快速检测各类癌症当中RNA甲基化相关酶&RNA甲基化水平(下)
又到了一周云序生物课堂开讲时间！你，准备好了吗？
上一期文章当中，云序通过引用这样一张表格给大家传递了一个重要信息：表中的METLL3、METTL14、NSun2、FTO、ALKBH5、YTHDF2均是RNA甲基化重要的酶，而且这些酶在不同疾病当中意义有所不同，例如METTL3在AML、BC、HCC当中都是原癌基因，而到了GBM当中竟然变成了抑癌基因；同样是甲基化酶，在HCC当中，METTL3是原癌基因而METTL14是抑癌基因。不管怎样这些酶都在疾病当中扮演重要角色，对疾病细胞的侵袭、增殖能力都有所影响，那么如何做到围绕一个酶把故事的来龙去脉讲清楚呢？
RNA甲基化从酶入手，高分文章立刻拥有，截至目前，RNA甲基化相关领域的研究仍在起步阶段，但围绕甲基化酶研究的思路已经是高分文章的首选策略。云序生物课堂，今天就想跟大家聊聊，如何从酶入手打造高分RNA甲基化文章：
1. 确定相应疾病背景下的酶
RNA甲基化相关的酶包括甲基化酶、去甲基化酶、识别蛋白三大类，到底选哪一个酶来做？良好的开端是成功的一半，哪个酶最值得研究成了首要问题。
RNA-seq检测相关酶的表达量改变
（DOI: 10.1111/acel.12753）
倍数表达变化改变总结
（DOI: 10.1002/hep.29683）
1）云序生物推荐mRNA测序结合qPCR的方式检测酶变化
mRNA测序能给出疾病模型或疾病样本中异常表达的所有基因，其中包括RNA甲基化相关的METTL14、METTL3、FTO和ALKBH5等重要的酶在RNA水平上的变化检测。在设置生物学重复的前体下优先选择倍数表达变化高的并且p值较小的酶作为潜在的研究靶点。qPCR技术可以对选择的靶点酶进行扩大样本量验证用于确定该酶的异常表达。
相关酶的WB蛋白检测
（https://doi.org/10.1038/s41590-018-0275-z）
2）蛋白检测
不仅局限于RNA水平，云序推荐结合Western Blot技术检测酶在蛋白水平上的变化，如果在RNA水平和蛋白水平都提供有力的证据证明酶表达量改变，则为接下来的实验奠定了坚实的基础。
大样本qPCR验证ALKBH5高表达与较差临床预后有关
（http://dx.doi.org/10.1016/j.ccell.2017.02.01）
3）数据挖掘
对于常见疾病，如癌症，现有的数据库已经有了相当丰富的疾病表达数据以及临床诊断和预后相关分析，友好的网页界面方便用户简单点击鼠标就可以快速知道疾病相关的表达图谱，这当然一定包含这些酶的信息。漂亮的生存曲线轻松绘制，临床效果显著相关的信息对于靶点的选择又是一剂强心剂。
综上，评价一个酶是否可以作为靶点进行研究主要看三方面，RNA表达改变（变化倍数和p值）、蛋白表达改变和临床意义。
2. 实验室中复盘酶的重要生物学作用
ALKBH5对细胞增殖的影响
（http://dx.doi.org/10.1016/j.ccell.2017.02.01）
METTL3促进肿瘤生长
（https://doi.org/10.1002/hep.29683）
1）最直接的方式就是对该酶进行过表达或敲除实验并观察细胞表型是否有改变
对于表型的定义针对不同类型的疾病模型有所区别，肿瘤细胞的细胞表型就是我们所熟知的细胞侵袭、增殖等。另外，裸鼠成瘤实验是证实甲基化酶调控细胞成瘤过程最直接手段。
整体水平RNA m6A比色法检测（Elisa试剂盒）
（DOI: 10.1002/hep.29683）
2）整体水平评价甲基化水平改变
甲基化酶或者去甲基化酶的过表达与敲除理论上会造成甲基化水平的广谱改变，此时可以使用商业化的比色法试剂盒来说明酶的人工干预对甲基化水平产生了影响。
3. 多组学联合运用找靶点：转录组测序甲基化测序，双剑合璧
多个表达谱数据取交集找到靶基因
（DOI: 10.1002/hep.29683）
甲基化数据同表达谱数据取交集
（http://dx.doi.org/10.1016/j.ccell.2017.02.01）
1）云序生物推荐MeRIP-seq测序技术对干预和未干预的生物学样品进行m6A甲基化测序，测序结果中会呈现甲基化位点的具体位置和差异甲基化位点的位置。测序结果当中会呈现超甲基化、去甲基化、高表达、低表达的相关基因，而建立这一关系的理论依据是甲基化水平的改变会造成RNA水平的改变。目前RNA甲基化使RNA水平下降是广泛接受的结论，影响方式可以通过降低RNA分子同HuR结合蛋白的结合力而使稳定性下降，也可以通过YTHDF家族蛋白识别并降解RNA的途径使RNA水平减少。是否有RNA甲基化能促进RNA的表达水平？目前还尚没有定论。
4. 灵活展示酶与下游靶基因的关系以及其他功能实验
确定了酶和酶潜在靶基因间的关系。通过整合多篇高分文章的内容，为大家梳理一下思路。
IGV软件上观测到靶基因上存在4处RNA甲基化的区域
（http://dx.doi.org/10.1016/j.ccell.2017.02.01）
1）验证靶基因的甲基化，mRNA和蛋白表达情况
任何高通量测序的结果都需要通过低通量的验证，通过MeRIP-qPCR，qRT-PCR和WB分别验证靶基因的甲基化和表达量情况。其中，若靶基因mRNA的表达量不改变，也不用太担心，因为甲基化修饰可能改变了该基因的蛋白翻译效率，做个WB试试。
RIP实验证实ALKBH5酶与靶基因直接结合
（DOI: 10.1002/hep.29683）
RNA Pull Down实验证实靶基因能与ALKBH5蛋白直接结合
（DOI: 10.1002/hep.29683）
2）RNA甲基化酶是否和靶点基因的mRNA直接结合
通过RIP实验，特异性借助RNA 甲基化酶抗体拉取样本中与其直接结合的RNA，再通过qRT-PCR手段，检测靶基因是否存在于拉取的复合物中，从而决定性的证实甲基化酶与靶基因是直接结合的。相反的，RNA Pull Down实验，借助根据靶基因合成的探针，特异性拉取与其结合的蛋白，通过WB手段，检测甲基化酶是否存在于拉取的复合物中。这样一来一往，就能明确两者是直接结合的。
3）解释酶对甲基化靶基因影响的工作原理
从酶入手研究RNA甲基化策略是这类高分文章的主流，上游的酶，下游的靶基因，建立联系一气呵成，根本上解释了甲基化酶、去甲基化酶以及识别蛋白通过靶基因对疾病的调控作用。云序生物提炼的这一思路适用于大部分疾病的RNA甲基化研究探索，RNA甲基化研究这么热，这么新，为什么不尝试用这种方式解释您关心的疾病、表型变化中甲基化所起到的作用呢？欢迎广大老师来电咨询云序技术团队，云序竭诚为您服务。
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