（提示 关于酶量的问题。通常的内切酶效价在10U/μL左右，3μL内切酶相当于30U，足够切10μL的质粒。因为通常小提质粒的浓度在200－600ng /μL，一般浓度达不到1μg/μL。根据1U酶切1μg质粒的原则，这一酶量是足够的。）
1%琼脂糖回收胶回收（碎胶、酚氯仿抽提法）

1. 酶切产物加入10％量的上样Buffer，混匀。使用1%的琼脂糖回收胶，电泳回收酶切产物。

2. 用手术刀切下所需要的大片断（载体）和小片断（插入片断），收入一个1.5mL离心管中。（提示: 切胶前，需用分别含酒精、NaOH和双蒸水的纸巾擦拭凝胶接触的台面，以防污染。 手术刀要火焰消毒，而后切胶回收。）

3. 12000rpm 1分钟，将凝胶甩到管底。 -20℃ 冰冻20分钟。

4. 取200μL Tip 头两只，在酒精灯上稍烤化Tip头尖端，两Tip头尖相对来回相接触，在Tip头顶部制成直径3mm左右的平头，准备用于碎胶。

5. 从-20℃取出冻结的凝胶，立即使用200μL枪套上平头Tip头，捣碎凝胶。（提示 200μL的枪足够粗壮，不要用100μL的枪，小心折断！！！ 乘凝胶比较硬时就开始碎胶，轻而频率高地捣碎凝胶）

6. 凝胶管中加入500μL双蒸水，盖紧，振摇200下。

7. 加入500μL Tris饱和纯酚，盖紧，振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心15分钟。

8. 在一新1.5mL 离心管中加入 500μL 氯仿：异戊醇（24：1），将步骤7的上清加入本步骤离心管中。盖紧，振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心5分钟。

9. 在一新1.5mL 离心管中加入 900μL 预冷 无水乙醇、20μL 3M的醋酸钠。将步骤8的上清小心加入本步骤离心管中。颠倒数次混匀。12000rpm 4℃ 离心15分钟。（提示 吸取步骤8中的上清时，千万不要将有机相吸入，宁可放弃一些上清，否则影响后面的连接反应。 另外，本方法使用的醋酸钠量较小，但足够沉淀核酸，并且无需洗盐。）

10. 弃上清，将离心管倒置于干净吸水纸巾上5分钟。室温下吹风干燥。（提示 可将试管至于超净台吹风干燥。如果管底有较多液体聚集，可盖好管盖后，轻弹管底数次，将液体分散挂在管壁上，再打开管盖吹风。）

连接

向回收DNA的试管中加入8μL 双蒸水，盖紧，弹击管底使液体尽量接触管壁。瞬时离心将液体甩到管底，再加入1μL ligase Buffer，1μL T4 ligase（连接酶）。弹击管壁混匀，瞬时离心将液体甩到管底。 置4℃过夜。 （提示 Ligase Buffer应该在首次融解后分装，每管可2-3μL，-20℃存储。 4℃过夜可获得最多的转化克隆 。）

二、PCR产物接入质粒的克隆

简介： 取100μL PCR产物，酒精沉淀、干燥，直接加入酶切体系酶切；将用作载体的质粒A（制作大片断）酶切3μL；切胶回收来自质粒A的大片段，和来自PCR产物的小片断，并回收到一管中；酚氯仿法回收DNA，酒精沉淀，干燥；加入8μL水、1μLligase Buffer、1μL ligase ，4℃过夜；次日转化涂板。

PCR产物回收

1. 制备100μL PCR产物。

2. 将100μL PCR产物加入一1.5mL离心管中，再加入400μL双蒸水，颠倒混匀。加入 900μL 预冷 无水乙醇、20μL 3M的醋酸钠。颠倒数次混匀。（提示 本方法使用的醋酸钠量较小，但足够沉淀核酸，并且无需洗盐。）

3. 4℃静置30分钟，以利于核酸沉淀。

4. 12000rpm 4℃ 离心15分钟，沉淀核酸。

5. 弃上清，将离心管倒置于干净吸水纸巾上5分钟。室温下吹风干燥。（提示 可将试管至于超净台吹风干燥。如果管底有较多液体聚集，可盖好管盖后，轻弹管底数次，将液体分散挂在管壁上，再打开管盖吹风。）