实验概要

此步骤描述了从组织中制备染色质，以用于后续的染色质免疫沉淀反应。每个免疫沉淀/抗体反应推荐使用肝组织 30 mg，但组织使用量可根据实际进行调整。每种组织的用量依据组织蛋白丰度、抗体亲和力和交联效率而定。每个免疫沉淀反应最适染色质的量为 5-15 μg 。

每次交联免疫沉淀反应之前，需根据不同组织类型确定具体的染色质需要量。应先按照下述方法制备染色质溶液，再进行交联免疫沉淀反应。所有溶液中均应添加蛋白酶抑制剂（10  μl/ml 的 PMSF，1 μl/ml 的抑肽酶和 1 μl/ml 的亮肽素，溶于 PBS 中）。

实验步骤

1.   交联

1)   用刀片将冰冻或新鲜组织切成小块 (1-3 mm³)。

2)   取一个空的 15 ml 锥形离心管，称重，放入组织后再次称重，计算组织重量。

3)   在通风橱中配制交联所用溶液。每克组织加 10 ml PBS。加入终溶度 1.5% (v/v) 的甲醛，室温旋转 15 分钟。

4)   加入甘氨酸至终浓度 0.125M，以终止交联反应。继续室温旋转 5 分钟。

5)   组织样本离心，4 °C 720 rpm，离心 5 分钟。

6)   吸弃培养基，用 10 ml 冰上预冷的 PBS 洗涤。4 °C 720 rpm，离心 5 分钟，弃掉洗涤缓冲液。

2.   组织降解

1)   将 1 ml 枪头的末端剪掉，使吸头口增大。

2)   50-100 mg（3-4 块）的组织用 1ml PBS 重悬。

3)   将溶液加入锥形研磨管中，研磨 2 分钟。

4)   将 18 号钝圆的针头连接到 1 ml 注射器上，将其插入锥形研磨管中收集细胞。将细胞加入一个锥形管中，冰上放置。

5)   重复步骤 2.2 直到所有组织均处理完。

6)   镜下观察细胞悬液，以确定得到的是单细胞悬液。如果需要进一步研磨，可在组织中加入更多的 PBS，重复步骤 2.2 到 2.5，直至所有组织均研磨成均一的悬液。

7)   将细胞离心，1000 rpm, 4 °C，离心 10 分钟。估算细胞沉淀的体积以备下一步操作。

8)   小心吸弃上清液，用FA裂解缓冲液重悬沉淀（每 1x10⁷个细胞加入 750 μl）。

9)   从第 2 阶段（超声处理）开始，继续进行交联染色质免疫沉淀反应。