qPCR常见异常曲线实战分析 （二）
图九：试剂蒸发引起扩增曲线抬升
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确定实验过程中的操作细节
如果以上都正常，还要确定下实验过程中的操作细节。
比如在做标准曲线的时候是否是梯度稀释的标准品，如果不是梯度稀释标准品，可能会引起标准曲线扩增效率或者R2值异常；
从冰箱冷冻中取出的试剂是否有混匀，如果试剂融化后没有混匀，这时候取出的试剂不是均一的，会影响后面的扩增；
定量PCR预混液跟核酸模板加好后是否混匀，如果没有混匀，特别是样本体积比较大的时候（超过PCR体系的20%），更容易发生optical mixing现象。
因为样本是水相会在上层，试剂（含有甘油成分）会在下层，在前期的PCR过程中不足以混匀完全，这样会形成折射，荧光较强，而一般加热几个循环后样本跟预混液会混匀，荧光就变稳定了（图十）。
图十：样本跟预混液未混匀现象
还有上机的反应体系里尽量不要有大的气泡，有气泡的话，中间容易形成折射，干扰荧光的采集（图十一）。所以实时荧光定量PCR实验的细节还是要特别注意的。
图十一：反应体系中有气泡
其他异常曲线，实战分析：
分液不准确，检查检测后的反应管可发现管内的PCR反应液量明显少于正常管； 反应管气密性差，反应过程中溶液蒸发引起探针浓度增加，导至曲线呈斜直线状。
分液均匀，上机前检查八连管液面是否在同一水平线上； 八连管盖盖严，上机前检查是否有缝隙。
排除是否存在污染； 排除污染原因后复检样本，如果复检后曲线为阴性直线则说明之前的末尾起跳为非特异性扩增，如果复检后曲线仍与之前一致则说明末尾起跳表示该样本中待检病毒核酸的浓度偏低。
qPCR实验室面临的最大问题就是核酸气溶胶污染的问题，每个实验室都要特别注意。
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