断裂-标记免疫电镜技术(1)
断裂-标记免疫电镜技术
此法是先进行冷冻断裂,再做免疫标记,从而可以对断裂开的各种膜结构及胞浆断面进行标记。
(1)临界点干燥法
①固定:1.0%~2.5%戊二醛PBS液4℃1~2h,PBS冲洗3min×3。
如为细胞悬液,可加入30%BSA后加入1%戊二醛,使BSA凝胶化,将凝胶切成2mm左右的小块,用30%的甘油-PBS浸透后置于用液氮冷却的Freon中冷却。
②冷冻断裂,将冰冻的凝胶小块放在盛有液氮的培养皿中,培养皿放置于二氧化碳-液氮槽中,用预冷的解剖刀切割凝胶小块进行冷冻断裂。
③解冻,置碎块于30%甘油-1%戊二醛磷酸缓冲液中解冻。
④置换甘油,放入1mmol/l 氨基乙酰甘氨酸磷酸液去甘油,PBS冲洗,3min×2。
⑤免疫标记。
⑥1%锇酸,室温固定30min。
⑦系列梯度乙醇脱水,临界点干燥,喷镀铂-碳膜,次氯酸钠清洗复型,蒸馏水洗,捞于有Formvar 膜铜网上透射电镜观察。
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