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功能研究/多肽合成仪

2018.7.11

运行原理

    多肽合成仪以固相合成为反应原理,在密闭的防爆玻璃反应器中使氨基酸按照已知顺序(序列,一般从C端-羧基端 向 N端-氨基端)不断添加、反应、合成,操作最终得到多肽载体。固相合成法,大大的减轻了每步产品提纯的难度。为了防止副反应的发生,参加反应的氨基酸的侧链都是保护的。羧基端是游离的,并且在反应之前必须活化。固相合成方法有两种,即Fmoc和tBoc。由于Fmoc比tBoc存在很多优势,现在大多采用Fmoc法合成,但对于某些短肽,tBoc因其产率高的优势仍然被很多企业所采用。
 具体合成由下列几个循环组成:
  1) 去保护:Fmoc保护的柱子和单体必须用一种碱性溶剂(piperidine)去 除氨基的保护基团
  2) 激活和交联:下一个氨基酸的羧基被一种活化剂所活化。活化的单体与游离的氨基反应交联,形成肽键。 在此步骤使用大量的超浓度试剂驱使反应完成。循环:这两步反应反复循环直到合成完成。
  3) 洗脱和脱保护:多肽从柱上洗脱下来,其保护基团被一种脱保护剂(TFA) 洗脱和脱保护。

基本元件

a)        反应器 Reaction Vessel
  数百年来,制药业的反应器/反应釜 设备以玻璃材质为常见,其完全透明且耐腐蚀,而被众多化学、生物学专家沿用。多肽合成的过程需要操作人员直观监测,同时合成后可进行在线切割(切割试剂TFA的强腐蚀性对反应器材质有了极大限制),这些要求限制反应器以玻璃材质为适用。 玻璃材质的反应器在制造工艺上有极大的难度限制:①烧制工艺:磨口精度要求极高,正如很多国产设备都无法达到要求出现漏液漏气现象,玻璃壁均匀程度等。②配合搅拌柄以及密封装置的成套加工工艺③防爆处理。而大规模生产型多肽合成仪由于考虑到安全问题几乎所有顾客都建议采用316L不锈钢材质,如Peptide Scientific Inc公司和CS Biog公司大型设备均采用316L不锈钢材质。
b)        氨基酸储罐 Amino Acid Reservoirs
c)        溶剂储罐 Solvent Reservoirs
d)        量筒 Metering Vessel
e)        转液瓶 Transfer Vessel
f)         感应器 Sensor
  多端触发器自感应定量量取法,直观、科学、相对误差最低。
g)        废液桶 Waste carboy
  废液桶通常选择容积较大的HDPE桶,保证通风良好,同时需安装感应器装置时刻检测废液情况,避免溢出。

控制配件

a) 电磁阀 Valves
    多肽合成仪中的电磁阀属于敏感配件,其控制液路的串联与闭路,在氨基酸转移与量取,溶剂转移与量取两步骤中起到至关重要的作用。不同品牌的合成仪对电磁阀的设计与排布也略有不同。
b) 控制面板 Control Box
 控制面板内往往含有光敏组建,部分控制电磁阀以及感应器控制组。与电脑主机的控制系统、合成仪统一的链接在一起,完成多肽合成的全过程。
c) 软件系统 Operating Software
 多肽合成仪的操作软件。不同品牌合成仪所注册的软件也不同。

检测方法

 a) UV Monitor
     在多肽合成仪中,在线检测耦合效果的装置,如UV Monitor往往是选配装置,客户可根据实验的需要选购。其功能是让操作者直观的看到多肽合成的每一部氨基酸偶联效果,从而针对特定的序列做合成设置的调整,最终达到最佳合成效果。

  对于不熟悉多肽合成仪操作的用户来说,UV Monitor是相当重要的。

b) 试剂检测:没有选购在线检测附件的多肽合成仪用户,也可以采用试剂检测方法做基本的耦合效果测定实验。
       固相多肽合成中,主要是通过检测树脂上游离氨基来判断连接效率,检测方法称为Kaiser方法,其检测结果,如果有游离氨基的时候,显示兰色,或红褐色(pro,ser,His)。

茚三酮检测原理茚三酮检测原理图册

       配制中的吡啶需要经过茚三酮处理后,重蒸后再使用。检测过程,取少量树脂,加入A,B,C各2-3滴,100℃下加热1-2min,如果溶液有兰色,或树脂出现兰色,红褐色,表明还有游离氨基,否则说明连接完全。

c) 其它检测游离氨基的方法三硝基苯磺酸法,苦味酸法,溴芬兰法等


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