植物根系活力测定(α-萘胺氧化法)
实验概要
掌握用α-萘胺氧化法测定植物根系活力。
实验原理
植物根系是活跃的吸收器官和合成器官，根的生长情况和代谢水平即根系活力直接影响植物地上部的生长和营养状况以及产量，是植物生长的重要生理指标之一。
植物根系能氧化α-萘胺，生成红色的α-羟基-1-萘胺，并沉淀于有氧化能力的根表面，使这部分跟染成红色。根对α-萘胺的氧化能力与其呼吸强度有密切联系。日本人相见、松中等认为α-萘胺氧化的本质就是过氧化物酶的作用，该酶的活力越强，对α-萘胺的氧化力也越强，染色也越深。所以既可以根据根系表面着色深浅，定性观察并判断根系活力大小，也可通过测定溶液中未被氧化的α-萘胺的量，以定量测定根系活力。
α-萘胺在酸性环境中可于对氨基苯磺酸（sulfanil-amide）和亚硝酸盐作用生成稳定的红色偶氮染料。该红色偶氮化合物在pH
7.0时在510nm处有最大吸收峰，可用分光光度法测定光吸收值，从而利用此反应来间接测定溶液中α-萘胺的量。反应液的酸度大则增加重氮化作用的速度，但降低偶联作用的速度，颜色比较稳定。增加温度可以增加反应速度，但降低重氮盐的稳定度，所以反应需要在相同条件下进行。
主要试剂
α-萘胺溶液
0.1mol/L磷酸缓冲液，pH 7.0
1%对氨基苯磺酸溶液
亚硝酸钠溶液
主要设备
分光光度计
恒温培养箱
三角烧瓶
量筒
移液管
剪刀
玻棒
实验材料
荇菜
实验步骤
1.
取50ug/mLα-萘胺和0.1mol/L pH
7.0的磷酸缓冲液各10ml置于三角瓶中，混匀。分别取不同浓度汞离子胁迫的植株的根系，洗净后再用滤纸吸干。分别称取根系1-2g浸没于三角瓶中的溶液中。同样地，取50ug/mL的α-萘胺溶液和0.1mol/L
pH 7.0的磷酸缓冲液各10ml置于另一三角瓶中混匀，不放根系作为对照。五分钟后分别从两瓶中各取2ml，按照步骤3做第一次测定。
2. 将三角瓶置于25摄氏度恒温箱中保温60分钟后，各取2ml，按照步骤3做第二次测定。
3. a-萘胺含量测定：取2ml培养液加10ml水 混匀，再顺次加入对氨基苯磺酸溶液与亚硝酸钠溶液各1ml混匀，观察溶液颜色变化再定容至25ml，室温25分钟后于510nm处测定吸光度OD值。
4. 标准曲线制作以50um/ml的a-萘胺溶液为母液配置40，30，20，10，5，0ug/ml 的溶液各10ml。各取2ml，按照步骤3分别反应，并测定OD值，以OD值为纵坐标，浓度为横坐标绘制a-萘胺溶液的标准曲线。
5. 分别查对标准曲线计算出实验组与对照组溶液试验前后对应的a-萘胺溶液浓度。
6. 根据实验结果计算不同植株根系对a-萘胺的生物氧化强度，并于植物生长势比较，分析它们之间的关系。
例如，1 g鲜根，振荡3小时，以第一次取样时的α-萘胺浓度为A（是根上吸附的氧化铁氧化α-萘胺后剩余的α-萘胺浓度，亦即酶促反应前α-萘胺的起始浓度），第二次取样时的α-萘胺浓度为B（即根在酶促反应3小时后剩余的α-萘胺浓度）。所以A-B为根的α-萘胺氧化量，C为空白试验时α-萘胺减少的浓度（即α-萘胺在振荡3小时的自身氧化量）。由于所用溶液是等体积的40 mg/Lα-萘胺溶液和磷酸缓冲溶液，共50 mL，所以每mLα-萘胺含量为20 μg，X为稀释液体积（mL），由于取样为2 mL，酶促反应是在48 mL的α-萘胺溶液中进行的，其计算公式如下：
其中：Y代表α-萘胺氧化量（μg/ g鲜根/小时）
3代表酶促反应时间
注意事项
为什么用紫外吸收法测过氧化氢酶活性时的平行测定相差会很大？同样的酶液，同样的方法，只是读数时间有几秒的差异，但是吸光度为什么会相差很大？测定前为什么要25度预热？读数都是负的吗？要是有正的说明什么？
解释是：酶的催化速度很快的，所以底物消耗得很快，催化速度的测定只能取直线变化的那段数据，只有这时的数据是可靠的。测定前要25度预热，预热是为了达到酶催化的最适温度，读数是不是负的，要看是拿什么溶液来校正的，底物减少，吸光度减少，数值就减少了，到最后就变成负的了，速度是用差值算的，和绝对数值无关。
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