培养液成份变化对胚胎发育的影响
胚胎体外培养的目的是保持胚胎的发育质量， 增加成功分娩健康婴儿的机会。培养液是胚胎体外 发育的能量补给站，培养液成份的改进，维持甚至改 善了胚胎在体外培养期间的发育潜能。胚胎体外培 养的主要目标是尽可能满足植入前胚胎发育的要求。胚胎在体外条件下，需要不断适应微环境的变化。在有效培养系统下，小鼠胚胎在体外获得了与 体内相似的发育速度与质量［ １］。现有商品化培养 液，能保持胚胎较好的体外发育能力。本文阐述了 胚胎培养液的设计策略、培养液的能量代谢与ｐＨ 缓冲的需求及研究结果，以期优化培养液使用策略， 促进胚胎发育。
一、培养液设计策略
卵裂期胚胎通常在输卵管中发育至囊胚后进入 子宫腔。在人类子宫中，胚胎发育的主要能量物质 （丙酮酸、乳酸或葡萄糖）的浓度，在整个月经周期中几 乎没有变化。子宫液中的丙酮酸浓度（ ０．１ｍｍｏｌ ／Ｌ）明 显低于卵泡期和月经中期输卵管液中的丙酮酸浓度 （ ０．２５ｍｍｏｌ ／Ｌ和０．３２ｍｍｏｌ ／Ｌ）。子宫液中乳酸 水平（ ５．８７ｍｍｏｌ ／Ｌ）也低于月经中期输卵管中的乳 酸水平（ １０．５０ｍｍｏｌ ／Ｌ）。相反，子宫液中的葡萄糖 浓度（ ３．１５ｍｍｏｌ ／Ｌ）明显高于输卵管中的葡萄糖浓 度（ ０．５０ｍｍｏｌ ／Ｌ） ［ ２］。这些观察结果表明，胚胎从 处于母体遗传控制之下偏好丙酮酸，到胚胎基因组 激活后转移到葡萄糖代谢。囊胚期胚胎表现出更高 的代谢需求。 依据着床前胚胎在不同发育阶段对培养条件的 特定需要，基于“回归自然”的理念，设计出序贯培养 液［ ３］。各种商品化的人类胚胎序贯培养液，都试图 模拟发育中的胚胎不断变化的需要，尽可能接近自 然环境。胚胎体外操作过程引起的细胞和代谢的应 激，胚胎被迫需要消耗能量来应对这样的外来环境 变化；同时人们对输卵管和子宫环境的认识进一步 加深，也促进了培养液成份的不断改进。 输卵管对配子、受精和早期胚胎发育具有特异 性和显著性的影响。早期宫腔环境对胚胎发育也十 分重要。人子宫液中氨基酸浓度为３．５４ｍｍｏｌ ／Ｌ。 宫腔中检测到的１８种氨基酸的相对浓度不受年龄、 体重指数、周期或特定良性妇科疾病的影响，但饮食 习惯会影响氨基酸的相对浓度，健康饮食与非健康 饮食的妇女的子宫液中，天冬酰胺、组氨酸、丝氨酸、 谷氨酰胺、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和亮氨酸浓 度存在差异［ ４］。 在动物胚胎体外培养过程中，为了尽可能接近 生理条件下的培养环境，在培养液中添加生殖道液 体。实验结果显示，精子上游液体中添加生殖道液 体后，提高了猪卵的受精率；胚胎培养液中添加了生 殖道液体后，提高了猪的囊胚质量，囊胚的细胞数量 增加、更易孵化。同时，培养过程添加了生殖道液体的胚胎，参与重编程、印迹和发育的基因受体外培养 的影响较少，更接近体内发育的胚胎［ ５］。 单一培养液不同于序贯培养液，将同一成份培 养液覆盖了从受精到囊胚的整个着床前胚胎的全程 体外培养过程。其设计思路是“让胚胎选择”，即在 培养液中，包括了所有浓度的混合物，而胚胎本身会 适应和利用它所需要的一切营养和能量，主动控制 离子梯度等，并能调节其内部环境。已有文献数据 显示，人类胚胎可以在单一培养液中连续培养至囊 胚期，而不需要在４８ｈ换液。单一培养液培养为胚 胎提供了更稳定的培养条件，胚胎的形态动力学参 数也未受影响，可产生更多的优质胚胎［ ６ －８］。
二、培养液的能量代谢
细胞的新陈代谢具有两种功能：一是提供细胞 维持细胞内稳态所需的能量，二是提供用于细胞生 物合成的物质。体外胚胎发育至囊胚的过程中，胚 胎的能量代谢存在发育阶段的特异性［ ９］。 总体上说，胚胎着床前，添加到胚胎培养液中的 主要能量基质有丙酮酸、乳酸和葡萄糖。早期阶段， ＡＴＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ
ｔｒｉ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，三磷酸腺苷）的代谢 相对较低， ＡＴＰ／ＡＤＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ
ｄｉ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，二磷 酸腺苷）比值较高，能量代谢的特点是消耗好氧底 物，如丙酮酸、乳酸和谷氨酰胺，葡萄糖利用少。桑 椹胚阶段，代谢活动开始急剧上升， ＡＴＰ／ＡＤＰ比值 下降，对能量的需求增加。细胞分裂的数量增加，蛋 白质的生物合成和与囊胚腔形成相关的离子泵作 用，成为能量的主要消耗过程。早期的首选营养物 质丙酮酸盐的吸收水平下降到非常低的水平，而葡 萄糖的吸收水平上升。 具体情况是，在卵丘－卵母细胞复合体中，卵母 细胞强调糖酵解和磷酸戊糖（ ｐｅｎｔｏｓｅ
ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐａｔｈｗａｙ，ＰＰＰ）途径［ １０］。糖酵解通过己糖激酶的活 性提供重要的能量来源。ＰＰＰ为嘌呤的合成提供 原料。己糖胺生物合成途径对于卵丘细胞的细胞外 基质扩张十分重要。多羟基化合物途径提供山梨醇 和果糖作为其他能量来源，维持氧化还原平衡。卵 母细胞和卵丘细胞之间的代谢也存在相互的作用。 与卵丘细胞相比，卵母细胞缺乏糖酵解高效代谢葡 萄糖、从醋酸酯合成胆固醇和直接摄取丙氨酸的能 力。相反，卵母细胞从卵丘细胞中获得糖酵解（如丙 酮酸）和胆固醇生物合成（如胆固醇）途径的产物以 及丙氨酸。同时，卵母细胞分泌旁分泌因子来促进 这一过程。受精后，受精卵以丙酮酸、乳酸等三羧酸为主要能量来源［ １１］。卵裂期胚胎的代谢以丙酮酸、 乳酸代谢为主、并以低水平氧化特定氨基酸为基础。 胚胎的代谢模式最初以丙酮酸为能量来源。当胚胎 发育到桑椹胚期以后，葡萄糖的消耗量急剧增加，从 低糖利用转化为高糖利用。小鼠囊胚中内细胞团 （ ｉ ｎｎｅｒ ｃｅｌｌ ｍａｓｓ，ＩＣＭ）几乎完全采用糖酵解方式， 滋养细胞（ Ｔｒｏｐｈｅｃｔｏｄｅｒｍ，ＴＥ）则消耗一半葡萄糖 转化为乳酸。葡萄糖需求的增加，为囊腔的形成和 维持提供了能量来源。囊胚腔的乳酸浓度比周围环 境更高。谷氨酰胺和脂质可分别通过三羧酸循环或 脂肪酸氧化，作为着床前胚胎发育各阶段的能量来 源。脂质代谢在８细胞期之前保持相对稳定，但在 ８细胞期和桑椹胚期之间突然增加。胚胎的平均耗 氧量在第一次分裂时达到峰值，胚胎致密化后耗氧 量下降到最低，然后逐渐增加到囊胚期［ １２］。囊胚中 两种细胞ＩＣＭ 和 ＴＥ的代谢也有差异［ １３］。与 ＴＥ 相比， ＩＣＭ 细胞的代谢相对安静。而ＴＥ比ＩＣＭ 包 含更多的线粒体，比ＩＣＭ 消耗更多的氧，也产生更 多的ＡＴＰ。与ＩＣＭ 相比， ＴＥ产生囊胚中大约８０％ 的 ＡＴＰ。ＴＥ产生能量的主要来源可能是位于ＴＥ 基底外侧膜上的 Ｎａ＋ 、 Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ（钠泵酶）。 囊胚培养液中存在过量的乳酸盐可能是造成胚 胎应激的一个因素。在对１０７名２３～４０岁之间的 患者进行的一项前瞻性同卵比对试验中，比较了使 用低乳酸水平或高６倍乳酸水平的培养液，发现在 低乳酸培养液中培养的胚胎，妊娠和持续妊娠的比 例更高，提示低乳酸培养液促进人胚胎的体外发 育［ １４］。两个独立的体外受精实验室分别使用序贯 培养液（ Ｇ－Ｓｅｒｉｅｓ）或单一培养液（ ＣＳＣＭ－ＮＸ）、单一 培养液（ ＣＳＣＭ）或单一培养液（ ＣＳＣＭ－ＮＸ），培养胚 胎至囊胚期，检测胚胎的非整倍体率，得出了一致的 结论。由于ＣＳＣＭ－ＮＸ的乳酸浓度较低，通过简单 地改变培养液乳酸浓度，使用低乳酸浓度的单一培 养液（ ＣＳＣＭ－ＮＸ）培养的胚胎，整倍体胚胎数量增 加了约１０％［ １５］。这提示了培养液中过量的乳酸盐， 可能通过影响细胞的纺锤体组装和染色体分离，改 变胚胎发育和细胞完整性，增加有丝分裂过程中非 整倍体的发生。
三、培养液的ｐＨ 缓冲
体外胚胎培养需要细胞内稳态，维持胞内ｐＨ （ ｐＨｉ），调节细胞发育。动物实验中，胚胎培养液中 添加弱酸 ＤＭＯ（ ５， ５ －二甲基－２， ４ －恶唑烷二酮），结 果显示：无论是在受精卵向２细胞或者２细胞向８细胞分裂期间短时间添加，还是从受精卵持续到囊 胚期的长时间添加，尽管囊胚发育和形态没有改变， 但均出现囊胚质量下降，细胞数量减少而凋亡增加。 第一次卵裂期间添加 ＤＭＯ，不改变种植结局，但胎 鼠体重、冠臀长均明显下降；而如果在整个着床前发 育过程中持续暴露于 ＤＭＯ 中，不但降低胚胎着床 率，而且降低胎鼠体重和冠臀长度。由此可见，细胞 内ｐＨ 值的轻微变化，可以显著影响胚胎发育和生 存能力，提示着床前小鼠胚胎对细胞内ｐＨ 高度敏 感［ １６］。适当而稳定的培养液ｐＨ 值，对维持胚胎持 续发育的能力显得至关重要。 ｐＨ 值的平衡取决于化合物的结合或离解。维 持细胞内稳态，最重要的离子是钠、钾、镁、氯和乳 酸。在人类卵裂期胚胎中，细胞内 ｐＨ 值为７．２。 培养液的ｐＨ 值主要通过培养箱提供的ＣＯ２浓度的 平衡和培养液中碳酸氢盐的浓度来调节［ １７］。升高 ＣＯ２会降低培养基的ｐＨ 值，反之则提高ｐＨ 值。平 衡的时间取决于 ＣＯ２在介质中的扩散和反应的时 间［ １８］。介质的体积、表面积、油层的使用等，都会影 响气体交换和平衡的时间。即使提供相同的ＣＯ２浓 度、相同的基础培养液，在不同的实验室之间可能会 产生不同的平衡时间。 在培养液中使用缓冲液有助于稳定ｐＨ。不同 的缓冲介质，缓冲能力是有差异的。监测碳酸氢盐 和 ＨＥＰＥＳ两种缓冲介质的培养液的实时ｐＨ 值 时，可以发现，大气环境下３ｍｉｎ后，碳酸氢盐缓冲 介质的ｐＨ 已经超过７．４，而 ＨＥＰＥＳ缓冲介质在 ７．３左右可以稳定１０ｍｉｎ以上。与单独添加ＮａＨＣＯ ３ 比较，两性离子缓冲显著增加了缓冲能力［ １９］。最常 用的缓冲液 ＨＥＰＥＳ和 ＭＯＰＳ，两者的ｐＫａ值都是 ７．２，是两性离子缓冲液中最接近于胚胎ｐＨ 值的。 其中 ＭＯＰＳ 在酸性范围内的 ｐＨ 缓冲稍好，而 ＨＥＰＥＳ在碱性范围内的ｐＨ缓冲稍好。将这两种广 泛使用的缓冲液以１∶１的比例（每一种１０ｍｍｏｌ ／Ｌ） 结合起来使用，比相同浓度的单个缓冲液，增加了有 效缓冲能力。与单独使用２０ｍｍｏｌ ／Ｌ的 ＭＯＰＳ或 ＨＥＰＥＳ相比，将两种缓冲液以１∶１的比例组合使 用，缓冲范围相似，允许ｐＨ 在 ＭＯＰＳ或 ＨＥＰＥＳ之 间缓冲。双缓冲介质（ＭＯＰＳ＋ＨＥＰＥＳ）的培养液， 有助于增强体外精子的存活能力。比较８ｈ与４８ｈ 两个时间点，双缓冲介质与单缓冲介质培养液中的 精子参数，发现双缓冲介质中的精子活力更好、前向 运动精子的比例更多［ ２０］。为了降低对胚胎的应激以及可能的毒性反应，只要维持适当的ｐＨ 稳定和 支持胚胎发育，应尽可能减少缓冲介质的浓度。
四、小结
胚胎培养液的总体设计策略，应该是在胚胎体 外发育时，通过提供底物，来引导胚胎采用相应的代 谢模式，利用内源性营养物质。培养液是配子与后 续胚胎体外发育相互作用的重要因素。作为人类胚 胎生长的外部环境，培养液的设计是复杂的，需要选 择合适和必要的成分，尽量减少对胚胎的应激。
