人血浆中缓激肽的SPE LC-MS/MS定量检测方法（三）
样品制备
将人血浆收集到含有EDTA和蛋白酶抑制剂的试管中，以防止体外形成缓激肽。使用Oasis
WCX（一种混合型吸附剂）进行SPE提取，提高提取的选择性。此吸附剂依靠反相和离子交换保留机制将复杂血浆样品中的缓激肽与其它高丰度多肽选择性地分离开来。Oasis
μElution96孔提取板可在无需蒸发和复溶的条件下富集样品。这不仅节省了时间，还减少了由于蒸发过程中收集板壁的吸附而导致的肽损失。预处理和清洗步骤的优化对于在样品预处理和SPE提取中完全回收缓激肽至关重要。使用酸或碱对样品进行预处理可降低粘度并增加与吸附剂的接触时间，有利于抑制蛋白质结合，还可以通过离子交换功能使肽在SPE设备中得到更好的保留。在最初的方法开发中，通过用酸预处理血浆获得了约80%的回收率。由于缓激肽是一种碱性的极性肽，其PI值为12.0，HPLC指数为47.8，因此怀疑它在最初的上样步骤中发生了部分洗脱。当使用碱进行预处理时，回收率增加至约90%，这有利于在上样步骤中通过离子交换改善缓激肽的初始保留性能。将清洗步骤2中的乙腈溶液由20%变为10%，消除了清洗过程中缓激肽的穿透现象，并使回收率提升至100%。在上样前对血浆进行碱预处理的优化SPE方案与采用10%乙腈溶液的优化清洗步骤相结合，实现了缓激肽的完全回收，且基质效应小于10%。此外，由于UPLC分离在反相色谱进行，因此利用离子交换实现的肽分离为整个方法赋予了正交性。
线性、准确度和精度
为了生成标准曲线，用以下最终浓度的缓激肽对人血浆进行强化：5、20、30、60、100、200、400、600、1000、2000、6000和10000
pg/mL。在人血浆中制备以下浓度的质量控制（QC）样品：25、80、250、800和5000 pg/mL。使用赖氨酸 -（脱-精氨酸9）-
缓激肽（最终浓度为0.5
ng/mL）作为缓激肽的内标（IS）。计算分析物峰面积与IS峰之间的峰面积比（PAR）。使用校准样品的PAR并应用单一浓度（1/x）加权线性回归模型构建人血浆样品的校准曲线。然后根据校准曲线，通过PAR值计算出所有QC样品的浓度。由于存在内源性缓激肽，因此采用标准品加入法。通过计算x轴截距确定对照血浆样品中缓激肽的平均基底浓度。然后，将缓激肽的基底浓度加入到所有标曲浓度和QC浓度，以实现准确定量。使用1/x回归，缓激肽所得曲线呈线性，R2值>0.99。表3所示为标准曲线性能汇总。QC分析结果示于表4中，内源性缓激肽和QC的典型色谱图如图5所示。所有浓度的QC样品都表现出极好的准确度和精密度，满足了有关LC-MS/MS检测的生物分析方法验证最佳实践白皮书中建议的FDA可接受标准4,5。人血浆中缓激肽的平均内源性基底浓度测得为79 pg/mL，SD和CV%分别为4.4和5.5。以上数据证实了这是一种稳定且可重现的方法。
