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膜片钳技术原理

2020.7.21

可兴奋膜的电学模型


      细胞膜由脂类双分子层和和蛋白质构成。脂质层的电导很低,由于双分子层的结构特点,形成了细胞的膜电容,通道蛋白的开闭状况主要决定了膜电导的数值。在细胞膜的电学模型中,膜电容和膜电导构成了一个并联回路。在细胞膜的电兴奋过程中,脂质层膜电容的反应是被动的,其电流电压曲线是线性的;而由通道蛋白介导的膜电导构成了膜反应的主动成分,它的电流电压关系是非线性的。

当改变跨膜电位时,膜电容和膜电导分别引发被动和主动电流:Im=Ii+CdV/dt,其中Im是流过膜的总电流,Ii是通道电流,CdV/dt是由膜电容介导的电容电流。为了考察通道电流就必须消除电容电流的影响,此时可以令dV/dt=0,即将膜电位钳制在一固定数值,使其不随时间变化,这就是电压钳技术的实质所在。

 

电压钳技术

 

     离子通道的近代观念源于Hodgkin、Huxley、Katz等人在20世纪30—50年代的开创性研究。在1902年,Bernstein创造性地将Nernst的理论应用到生物膜上,提出了“膜学说”。他认为在静息状态下,细胞膜只对钾离子具有通透性;而当细胞兴奋的瞬间,膜的破裂使其丧失了选择通透性,所有的离子都可以自由通过。Cole等人在1939年进行的高频交变电流测量实验表明,当动作电位被触发时,虽然细胞的膜电导大为增加,但膜电容却只略有下降,这个事实表明膜学说所宣称的膜破裂的观点是不可靠的。1949年Cole在玻璃微电极技术的基础上发明了电压钳位(voltage clamp technique)技术,基本原理如下:

     

 

      电压钳技术的核心在于将膜电位固定在指令电压的水平,这样才能研究在给定膜电位下膜电流随时间的变化关系。在上图中,膜电位Vm由高输入阻抗的电压跟随器所测量。钳制放大器在比较了膜电位和指令电位E之后,通过电阻Ra将电流注入膜内以控制膜电位。钳制放大器的输出:Vo=A(E-Vm),因为这个输出由电阻Ra和膜所分压,所以输出电流:I=(Vo-Vm)/Ra。由这两个关系可推出:Vm=EA/(1+A)-RaI/(1+A)。因此若钳制放大器的增益A极大,膜电位Vm和指令电位E之间的差别就可以忽略,即实现了电压钳制。

     Hodgkin、Huxley和Katz应用电压钳技术研究枪乌贼巨轴突,结合同位素示踪和胞内灌流等技术发现:动作电位的初期,细胞膜主要对钠离子的通透性发生改变,胞外的钠离子迅速内流,并产生所谓的“超射”现象(overshoot);随后对钠的通透性的急剧减少并且对钾离子的通透性增加。兴奋期的膜电位存在“超射”现象也是膜学说所不能解释的。

     根据这些实验,Hodgkin、Huxley和Katz在其1949—1952年的一系列论文中提出了“离子学说”或“钠学说”。认为当膜的去极化超过一个临界值时,就会触发动作电位的产生。在此期间,钠电导迅速上升,钠离子大量内流,使得膜电位接近钠的平衡电位;随后钠电导迅速失活,钾电导逐渐增加,引起膜电位的复极化。

    Hodgkin和Huxley通过对电压钳位实验数据的分析,给出了所谓的Hodgkin—Huxley方程。他们将膜电位钳制在不同的水平,观察钾电导或钠电导随时间的变化,然后用一个常微分方程去逼近所得到的实验曲线,而这些微分方程中的参数则假定跟离子通道上的“粒子”相关。根据H—H方程,能够推导出动作电位的阈值、形状、幅度等性质。并且在去除电压钳制的条件下,可以得到一个以电压和时间为变量的偏微分方程,由它可以给出和真实状况相符合的神经冲动的传导。

 

膜噪声和噪声分析

 

     Katz等人在1970年代初期研究了蛙神经肌肉接头处肌纤维膜电位的波动。他们根据对这种膜电位“噪声”的分析,提出了量子释放的概念,认为神经递质是以囊泡的形式从突触前膜释放到突触间隙中。并且Katz等人借助这种新的“噪声分析”方法(fluctuation analysis),能从突触后膜电位的“噪声”中推测出单位事件的幅度和时程。Anderson、Stevens、Colquhoun和Sigworth等人进一步发展了“噪声分析”。

     “噪声分析”的实质在于二项分布期望和方差之间的关系。假定通道只有开和关两个状态,并且各个通道的开关是独立的。若N是通道的总数,p是通道的开放概率,i是单通道电流,I是膜电流的期望值。则有:I=Npi,var(I)=Np(1-p)i2,即:var(I)=iI-I2/N。用var(I)对I作图,这显然是一个开口朝下的抛物线。微分这个二次方程得到曲线的斜率:dvar(I)/dI=i-2I/N,当I=0时的斜率就是单通道电流,根据钳制电位和反转电位之间的差就可以算出单通道电导;在抛物线的顶点即当:dvar(I)/dI=0时,I=Ni/2,由此可算出离子通道的总数。


                                       

 

膜片钳技术

 

     “噪声分析”只能推算离子通道的电导和时间弛豫过程,而不能直接观测通道的门控动力学。1976年德国马普学会生物物理化学研究所(Göttingen)的两位科学家,Neher和Sakmann在电压钳技术的基础上创立了膜片钳技术(patch clamp technique)。“膜片钳”的本意就是对小片细胞膜进行电压钳位,然后观测通过这一小块膜片上单个离子通道的电流。其电路原理示意图如下: 

 

    

      膜片钳技术的基本原理是通过负反馈使得膜电位与指令电压相等,在电压钳制的条件下记录膜电流。上面是电阻反馈式膜片钳放大器的电路示意图。A1为一极高输入阻抗、极低噪声的场效应管运算放大器,由于A1极高的开环增益使得两个输入端的电压几乎完全相等,从而实现电压钳制。Rf为一数值可切换的反馈电阻,分别对应于不同的电流记录范围,其中高值反馈电阻具有极高的电阻和极低的杂散电容,是决定放大器单通道记录性能的基本元件。A2为一差分放大器,它的输出即为电极电流和反馈电阻的乘积。由放大器A1和A2构成的回路称为电流—电压转换器,是膜片钳放大器前级(headstage)的核心。

      Rs是由电极和细胞之间的通路所构成的串联电阻,会引起全细胞电压钳记录的点钳制问题,这可通过Rs Comp回路来消除。电极入液之后会产生所谓的“快电容”Cp,即内外液相对于电极壁形成的杂散电容,在形成GΩ封接后变得更明显。而当吸破细胞膜形成全细胞模式后,还能观测到“慢电容”Cm,即对于细胞膜的充放电而产生的电容电流。可以通过电容补偿回路来消除这些电容尖峰的影响。由于阻容藕合电路中电阻和电容值的不同,快慢电容的幅度和时间常数都不同。对于有突起的细胞如脑片中的神经元,还存在空间钳制问题,这就难以从电路上消除它的不利影响。

     全细胞膜片钳模式下有电压钳记录和电流钳记录两种。电压钳记录的原理与电压钳技术相似,但有所不同:首先,全细胞电压钳记录只使用单根电极,但在电学效果上同时实现了电压钳制和电流记录。其次,电压钳记录的电极不插进细胞,对细胞造成的损伤较小,因而能用于小细胞如神经元的研究。电流钳记录则是通过钳制电极电流来测量膜电位。电流钳在本质上也是电压钳位,它将差分放大器的输出电流与指令电流相比较,然后将这个差动输出施加到放大器前级的倒相端,通过高速反馈使得同相端的电压与其相等,无论电极电流是否为零,都能从输出电压得到膜电位的准确数值。

      根据细胞膜的电路模型,全细胞模式还可用于监测膜电容的变化。当通过电极给细胞膜一个高频正弦波时,由于膜电容的存在,膜电阻的反应会有一个明显的相位滞后,这个时间延迟由膜电容、膜电阻和电极电阻三者决定。当后面两个因素固定时,膜电容的变化就会引起膜电阻反应与输入之间的相位差的变化。对于各种分泌细胞:胰岛细胞、肾上腺分泌细胞或神经分泌细胞,细胞的分泌伴随着膜表面积也就是膜电容的变化,可以通过监测相位差的变化来观测细胞的分泌过程。

     单通道记录的关键在于降低背景噪声。电阻反馈式放大器存在两个问题:一是反馈电阻本身的热噪声;另一个是反馈电阻本身的杂散电容。对于前者,当采用大电阻值反馈电阻时,就能将热噪声降低到可以接受的范围。但反馈电阻的杂散电容与电阻形成一个低通滤波器,按照现在的工业标准(50G,0.1pF),这个滤波器会使采集到的单通道信号严重失真。对于这个问题,可以采用一个高频提升器(high frequency boost),信号经过这样的处理就会引入高频噪声,因此必须经过低通模拟滤波。

     1976年在封接电阻只有10—20MΩ的情况下,记录了蛙去神经支配的肌纤维膜乙酰胆碱受体的单通道电流,由于背景噪声的影响,单通道电流矩形脉冲的形状很不明显。若要记录单个离子通道的微弱电流,就必须将噪声降低到极小,但按照‘Johnson’公式,由带电粒子的热运动所引起的电流噪声为:Irms = (4kTfc/R)1/2,因此就必须极大地提高电阻。因为放大器输入阻抗、膜片电阻和反馈电阻都很高,所以必须极大地提高封接电阻。

     后来发现当略施负压之后封接电阻很快上升到了GΩ的范围,背景噪声急剧下降,使得高分辨率的单通道记录变为可能。随后Hamill和Horn等人将小块膜片从细胞膜上分离下来而不影响封接,这样就形成了单通道记录的三种模式:细胞贴附式、内面向外式、外面向外式,连同全细胞模式于是便有了膜片钳的四种经典记录模式。Hamill等人在1981年发表的奠基性论文标志着膜片钳技术的成熟,随后在全世界各个生理学、神经生物学和生物物理学实验室得到了广泛的应用,极大地推动了离子通道和相关学科的研究。


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