如何根据细胞种类的特性科学铺板培养
细胞铺板是细胞实验中最常见又必须掌握的一门技术，看似简单，我们却经常遇到：如细胞居中或者中间稀疏等不均匀分布的现象，导致我们只能扔掉，重新铺板。既耽搁时间又浪费了细胞及培养板等资源。历经多次失败后，才发现原来细胞铺板是有规律可循的，今天我们就聊一聊：细胞铺板的技巧。
如下图为：细胞铺板时，常出现的细胞分布不均匀现象。
细胞居中和细胞边缘化
首先，了解一下细胞铺板的必要性！
从经济和高效的角度来说，需要根据实验目的选择不同规格的培养板。如在进行药物对待测细胞半抑制率（IC50）测试时，通常使用96孔板，一方面可以设置浓度梯度；另外还可一次性测多个药物，减少实验误差。
如下表格：
常见的几种培养板规格及其应用
细胞铺板主要分为3大步骤：收集细胞→细胞计数→细胞铺板
一、收集细胞
即把培养皿/瓶的细胞消化收集，与传代一样，不再赘述。
二、细胞计数
一般传代的细胞密度较大，在铺板时最好控制细胞数量。一般采用血球计数板计数，对于体积较大的细胞如肿瘤细胞采用下图蓝色部分的白细胞计数区域，即利用四个角的四个大方格。
血球计数板模式图（图片来自百度）
计算原理：由于每个大方格子（红框），边长为1mm，盖上盖玻片后的高度为0.1mm，因此计数室内加满细胞悬液的体积为0.1mm3=10-4cm3=10-4ml。
细胞数量 = 4个大格子的平均数*稀释倍数*104个/mL
常见问题解答：
Q：细胞计数前后出现较大误差？
考虑细胞沉降导致悬液不匀；悬液体积过大或过小；稀释倍数太高或太低等原因造成。
Q：如何克服细胞悬液不均匀的问题？
尽量将细胞吹打为单个，防止抱团，且用移液枪充分吹打，使其均匀悬浮在培养基中。
Q： 一般加多少细胞悬液合适？
由于加入计数室的量，过少会导致计数室内出现气泡，过多则会使得计数板上的盖玻片不紧贴计数板，使得高度变高，体积变大；计数室体积为9mm3，所以一般加15ul左右。
Q： 计数时，细胞稀释倍数如何控制？
若是计数室细胞过稀或过密，会造成较大误差，一般最适浓度为5～10×105细胞/ml。如一般10cm皿的细胞约300-500万个，一些细胞个体小也能达到1000-2000万，可根据所需细胞数目取出部分作稀释或连续稀释后计数。举例来说可将100ul细胞悬液加入到900ul培养基中，混匀后进行计数，计数所得乘以10即为实际细胞密度。
Q： 计数的原则有哪些？
计数时对压在最外圈边线的细胞遵循“计上不计下，计左不计右”的统计学原则，遇到两个以上的细胞组成的细胞团计为一个细胞。
三、细胞接种
根据操作手法，一般分为2类：
第一类：6孔板、12孔板和24孔板
各种培养板规格（来自Thermo Fisher）
操作步骤：
① 稀释细胞：根据上述计数结果后，将细胞稀释到目的浓度；
② 加入细胞悬液：充分混匀后，贴壁加入细胞悬液；
③ 摇匀：这一步很重要！接种结束后，将板在超净台上十字形摇匀，最后于显微镜下观察。
注意事项：
铺板后，不可以转圈摇，因为细胞会被带到中间；
如果培养液量少，由于瓶体内液体有向边缘吸的特性，所以造成中间低洼，细胞容易聚集。可以多加点液体缓解，若6孔板一般加2ml，我们可以加到2.5ml。
第二类：96孔板/384孔板
96孔板/384孔铺板时步骤与上述基本一致，只是多使用排枪，即不用摇匀。
96孔板/384孔板（来自Thermo Fisher）
注意事项：
用排枪吸取时，一定要保证每个枪头吸上来的悬液体积一致；
铺96孔板时，如果是用于进行MTS等长时间测试时，最外圈应空余出来，不接细胞，加入一圈PBS或多于细胞悬液，以防止培养基蒸发引起的边缘效应；
96孔板或384孔板铺好细胞后最好不再摇晃，小心地放入培养箱即可。
常见问题解答：
Q： 如何避免每个孔之间的细胞不均匀？
铺板速度尽量快点，在加完半边板后，需要再次将培养皿内剩余的细胞悬液充分混匀再继续铺板。
Q：十字形摇匀具体是怎么摇？
放在水平板面上先上下移动，再左右移动，每个方向5到6次。
Q：对于某些容易聚团的细胞，该怎么办？
对于容易聚团的细胞，尽管当时摇匀了，但是静置30min后，取出后将细胞培养板后，肉眼即可见严重的细胞居中抱团现象，比如乳腺癌细胞MDA-MB-231。对于这种细胞解决办法：从个人经验来看，若是时间允许的话，可以降低接种密度，可以隔一天细胞多了再进行药物处理或者划线等。
Q：为啥要贴侧壁加入细胞悬浮液？
一般从孔的左边靠近底部贴壁加入，不要从中间加入；因为接种之前已将细胞悬液做过充分混匀，直接从侧壁加入能尽量保持细胞悬液的均匀状态；另外贴侧壁加入也能减少孔内气泡的产生。
Q：如何把握细胞密度？
细胞密度对于铺板很重要，过密很容易造成细胞居中，过稀会造成细胞难以生长起来。一般进行预实验，我们通常会设计一组不同细胞密度对报告基因度值影响的预实验，从而根据实验结果来确定细胞的具体接种数量。
Q： 有些贴壁不牢的细胞在细胞培养板中收取上清或移除上清时应注意什么？
有些细胞如293T细胞贴壁不牢，如果需要在96孔板中进行实验时，如果需要吸除上清，应避免直接使用吸泵等吸力过大的设备，另外可以在收板时使用培养板专用离心机离心后在取出上清。另外也可以在接板前使用千分之一的明胶提前加入培养板中，在培养箱孵育30分钟以上后再将细胞接入。
细胞铺板是个熟能生巧的实验，本期我们是根据多年实战经验介绍的技巧，供大家参考，但鉴于每个人手法不同，培养的细胞特性也因人而异，因此，还需要实践中多多练习，了解你手中细胞的特性，进而拥有一套属于你的操作手法。如果你的实验中有更好的方法，也欢迎大家积极讨论，互相学习！
