酶切

直接在回收PCR产物的试管中配置酶切体系：

PCR产物酶切－制作插入片断

公用Buffer 6μL

酶 I 3μL

酶 II 3μL

PCR产物 ——

双蒸水 48μL

合计 60μL

要将PCR产物接入的质粒载体A，取A质粒3μL进行酶切。

A质粒酶切－制作载体片断

公用Buffer 3μL

酶 I 1μL

酶 II 1μL

质粒 3μL

双蒸水 22μL

合计 30μL

混匀

37℃，酶切3小时。

1%琼脂糖回收胶回收（碎胶、酚氯仿抽提法）

1. 酶切产物加入10％量的上样Buffer，混匀。使用1%的琼脂糖回收胶，电泳回收酶切产物。

2. 用手术刀切下所需要的大片断（载体）和小片断（插入片断），收入一个1.5mL离心管中。 （提示 切胶前，需用分别含酒精、NaOH和双蒸水的纸巾擦拭凝胶接触的台面，以防污染。 手术刀要火焰消毒，而后切胶回收。）

3. 12000rpm 1分钟，将凝胶甩到管底。 -20℃ 冰冻20分钟。

4. 取200μL Tip 头两只，在酒精灯上稍烤化Tip头尖端，两Tip头尖相对来回相接触，在Tip头顶部制成直径3mm左右的平头，准备用于碎胶。

5. 从-20℃取出冻结的凝胶，立即使用200μL枪套上平头Tip头，捣碎凝胶。（提示 200μL的枪足够粗壮，不要用100μL的枪，小心折断！！！ 乘凝胶比较硬时就开始碎胶，轻而频率高地捣碎凝胶）

6. 凝胶管中加入500μL双蒸水，盖紧，振摇200下。
7. 加入500μL Tris饱和纯酚，盖紧，振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心15分钟。

8. 在一新1.5mL 离心管中加入 500μL 氯仿：异戊醇（24：1），将步骤7的上清加入本步骤离心管中。盖紧，振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心5分钟。