高通量测序平台发展及在临床分子诊断中的应用

自2000年人类基因组计划完成，测序技术得到了快速的发展。在美国ABI公司基于末端终止法的第一代测序基础上，各大公司相继推出了不同的NGS测序平台。

核酸（DNA和RNA）测序技术的发展推动了医学对遗传病分子特征的认识。以揭示疾病分子特征为目的的高通量测序，即下一代测序（next generation sequencing，NGS）技术，已成为当前精准医学的重要组成部分。NGS以其高效、廉价等特点显示了在临床分子诊断应用中的技术优势，为精准医疗提供了坚实的分子依据。

NGS发展的关健技术

自2000年人类基因组计划完成，测序技术得到了快速的发展。在美国ABI公司基于末端终止法的第一代测序基础上，各大公司相继推出了不同的NGS测序平台。

2004年，美国生命科学公司推出基于焦磷酸测序方法的第1台NGS仪。2006年，Illumina公司推出了基于边合成边测序的Solexa测序平台，该公司已经推出了多种型号的测序平台，如MiSeq、HiSeq、NextSeq等系列，其中MiSeq系列适合于小型基因组测序，HiSeq系列适用于大型基因组测序。2007年，美国应用生物系统公司也推出基于边合成边测序的SOLiD测序平台。该平台基于连接酶法，即利用DNA连接酶在连接过程之中测序，以4色荧光标记寡核苷酸的连接合成为基础，测序准确性得以提高。

2010年，美国生命科学公司发布了半导体测序平台，如PGM。该测序技术与以往的基于光学信号的检测技术不同，使用了一种布满小孔的高密度半导体芯片，一个小孔就是一个测序反应池。当DNA聚合酶把核苷酸聚合到延伸中的DNA链上时，会释放出一个氢离子（H+），反应池中的pH值发生改变，位于池下的离子感受器感受到H+信号，H+信号再直接转化为数字信号，从而读出DNA序列。

太平洋生物科学公司2010年发布了第3代单分子实时（single molecule real-time，SMRT）DNA测序平台，2012年又推出了基于纳米孔的第四代基因测序技术平台MinION。它的特点是单分子测序，测序读长长（超过150 kb），测序速度快，测序数据实时监控，机器方便携带等，2015年MinION在临床开始使用。

NGS的临床应用范围和扩展领域

随着NGS技术标准化和规范化不断完善，其已广泛应用于常规临床实践，应用领域包括无创产前检测（noninvasive prenatal test，NIPT）和胚胎植入前遗传学筛查（preimplantation genetic screening，PGS）和胚胎植入前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis，PGD）、遗传病、肿瘤和药物基因组等。

国家食品药品监督管理总局（CFDA）于2014年11月批准首个用于胎儿染色体非整倍体检测的NGS诊断试剂盒，并成为临床应用最为成熟的NGS检测试剂盒。2015年1月我国正式启动"辅助生殖机构开展高通量基因测序植入前胚胎遗传学诊断临床应用试点工作" ，为NGS应用于PGS/PGD提供了依据，前者通过确保具有更高植入机会并导至活产的整倍体胚胎的转移来提高体外受精的成功率，后者能够识别具有特定致病突变和未受影响的植入胚胎。PGS/PGD优点在于能够利用单一平台实现单基因病和染色体异常分析。

NGS已经被广泛应用于遗传性疾病的检测，如心血管遗传病、眼部遗传病和线粒体疾病等。随着检测费用降低和基因解读能力提高，NGS应用于遗传病特别是罕见病，已由靶基因组合测序（target sequencing）向全基因外显子测序（whole exome sequencing，WES）和全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）转变。当靶基因组合测序不能满足临床需求时，应该选择WES或者WGS，随着测序成本进一步下降，WGS甚至有可能完全取代WES和其他涉及选择性捕获目标序列的技术。

目前肿瘤NGS检测主要应用于来源于体细胞突变的肿瘤分析，如非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）、结直肠癌等，通过NGS分析肿瘤中的基因变异，即常说的伴随诊断，为肿瘤的靶向治疗提供依据，同时也用于肿瘤分子分型、预后评价、耐药性分析及复发监测等。肿瘤NGS检测也可用于来源于生殖细胞变异的遗传性肿瘤综合征筛查，如遗传性乳腺癌，通过NGS技术，筛查具有肿瘤家族趋向者，有利于将肿瘤防治措施前移至预防阶段，如美国国立综合癌症网络指南近年来指出，利用NGS检测遗传性乳腺癌、卵巢癌相关基因突变并行遗传咨询和结直肠癌风险评估等。2006年启动的癌症基因组计划（Cancer Genome Project，CGP）项目，截止目前为止，该项目已经发掘近500万个肿瘤体细胞基因突变，并建立了全世界最大、最广泛的癌症体细胞突变数据库，为后续NGS临床应用打下坚实基础。通过肿瘤NGS，可以更早地发现肿瘤发生、发展的驱动突变，建立更加精密、精准的癌症诊断系统，然后进一步将驱动突变与相关靶向药物联系起来，从而更好地指导癌症的精准治疗。我国CFDA也与2018年9月批准了国内首个应用于临床肿瘤检验的高通量基因测序试剂盒。

NGS在肿瘤液体活检应用也逐步得到了认可，尤其是无法获得肿瘤组织时，如靶向治疗过程中的监测、活检失败或无法获取肿瘤组织等。大量研究证实，肿瘤患者外周血含有游离肿瘤DNA（circulating tumour DNA，ctDNA），其取材便利，适用于肿瘤个体化诊断、预后、复发风险评估。国内外先后发布了NSCLC中ctDNA检测的指南，为临床开展ctDNA的NGS提供了依据，为肿瘤分子分型和个体化治疗提供精细化指导。

以肺癌为例，已经有10余种靶向药物在国内获批上市，同时还有几十种药物正在开展临床实验。

肺癌获批靶向药物（FDA：美国食品药品监督管理局，NMPA：国家药品监督管理局）

基于这些靶向药物的多样性，临床检测需求已经从单一基因推进到了多基因平行检测，患者如果想通过一次检测筛选出所有可能获益的药物，传统分子方法将难以胜任。

美国食品药品管理局公布了220余种药物，建议通过遗传信息指导其合理使用。临床药物基因组学实施联盟（Clinical pharmacogenetics implementation consortium，CPIC）发布了35个药物临床药物基因组学应用指南（https：//cpicpgx.org/guideline/）。因此应用NGS技术可以得到单个患者成百上千个基因分型结果，全面指导其用药。

此外，NGS技术在病原微生物的快速鉴定、法医鉴定和HLA配型等多个领域具有潜在的应用优势，特别是近年发展起来的基于纳米孔测序的第四代测序技术，同时可以检测多种细菌或病毒，为微生物的快速鉴定提供了强有力的分子诊断工具。

NGS技术在分子诊断中的优势

对于单基因遗传病，以往临床实验室主要借助于一代Sanger测序、基因芯片、等位基因特异性聚合酶链反应（allele-specific polymerase chain reaction，AS-PCR）、荧光原位杂交等技术进行检验。随着致病基因的不断发现，特别是针对癌症、感染性疾病和心血管疾病等遗传病，传统的分子检测方法已经不能满足临床分子诊断同时多基因检测技术的需求，而NGS技术以其高效、廉价的特点则恰恰显示出在这个领域的技术优势。

NGS技术与其他分子诊断技术相比，具有以下几方面的优势：（1）通量高。以HiSeq X Ten为例，每年完成人类全基因组测序的量可达到18 000个左右；（2）可以多重检测。在同一批次的检测中，除了可以检测多个不同基因外，也可以同时检测多个不同来源的样本；（3）速度快。特别是半导体测序仪和纳米孔测序，每次运行所需时间仅数小时；（4）自动分析。针对高通量测序的数据，目前已经开发了一些列配套的自动分析软件，无需人工进行分析，大量节省了人力；（5）测序成本低。应用NGS检测平台对数十个基因的测序成本与应用Sanger技术对单个基因的测序成本大致相当，并远远低于其他如基因芯片、荧光定量PCR检测平台；（6）所需样本量少。对DNA样本的要求仅为ng数量级，特别是对于取样不均一的样本，NGS能稳定检测>1%的突变信息，对于检测异质性相对较高的肿瘤样本特别重要；（7）可与其他基因检测方法同时进行，NGS主要用于检测基因变异。总之，NGS技术能够一次性对多个靶基因进行准确检测，具有所需样本量小、敏感性高、检测成本低、耗时短等优点。

我国NGS技术发展需要注意的几个问题

当前国内NGS技术硬件制造和国外发展同步，但软件开发和数据分析人员培养滞后。NGS技术硬件可以通过购买迅速完成，其次国内也在逐步进行NGS硬件制造，目前国内在开发NGS硬件的公司主要有华大基因、赛纳生物科技和中科紫鑫等公司，2018年国家发改委等8部委联合发布《关于促进首台（套）重大技术装备示范应用的意见》（发改产业〔2018〕558号），力促国内NGS的硬件制造，华大基因于2018年底推出了全新的MGISEQ-T7高通量基因测序仪。国内软件开发和数据分析人员培养需要长时间积累，经过多年的积累，目前在多个领域逐步制订了符合我国国情的规范的检测指南和合理有效的监管措施，并初步完善了数据库系统以及符合患者需求的遗传咨询体系等。其次近年来，我国也逐步加大了NGS数据分析人员的培养与培训，如卫生部临床检验中心定期举办的高通量测序技术培训班，但与国外比较，尚存在较大差距。此外，需要积极提倡标准化和规范化用语，尤其是疾病命名与分类、疾病临床表型描述等，以便保证临床和检测实验室沟通顺，避免给基因数据解读带来困难。

国内企业发展正在从野蛮生长走向质量和规范

国内肿瘤基因检测行业优秀企业的技术已经与国外同类企业处于同等水平，为了使行业走向规范管理，NMPA (国家药品监督管理局)逐渐对基因检测试剂盒进行审批，世和基因、艾德生物、诺禾致源在内的多家企业肿瘤NGS检测试剂盒的获批：

以及卫健委临检中心组织的一系列高通量测序技术审核和室间质量评价，我们都可以看出政府和相关机构正在积极拥抱技术的发展，高度认可NGS的临床价值，并进行相应的行业规范化管理，以期营造一个保护创新、良性循环的大环境。

实验室 PT 成绩情况

成绩为 100 分的实验室

同时，还有多种国际质量认证体系（如ISO15189、CAP、CLIA等）已经开始有效监控和提高实验室质量水平：

多家基因检测实验室通过CAP认证

（排序不分先后）