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翻译后修饰蛋白质的定性和定量实验6

2019.3.28

七、P T M 的定量分析

当研究 P T M 的生物学意义时,如能了解一个特定修饰或一组P T M 的相对或绝对丰度通常会有帮助。这样可以将不同的生物样品间的目的修饰进行直接比较。例如, 将正常与疾病状态下细胞或组织内某一 P T M 的丰度进行比较。定量分析这些变化能够帮助深人了解 P T M 在细胞生长、疾病和凋亡等无数过程中扮演的角色。许多方法可以量化P T M ,传统方法使用2I> G E 和鉴别染色法来鉴定样品中蛋白质表达水平的差异。然 而 ,这个方法分辨率低,并且可能会由于一些蛋白质染色能力的不同而导致产生假象(O n gand M a n n , 2005)。 2D ——G E 是最适宜用来分析蛋白质丰度的方法 ( A n d e r s o n and A n d e r -s o n, 1998)。就在最近, 基于质谱的方法减轻了基于凝胶的方法带来的问题。基于质谱的方法包括蛋白质或肽段标记策略、标签手段以及利用谱图计算的差异蛋白质组学法(Gygi et al. , 1999; O n g et a L , 2002; W a s h b u m et al., 2001)。尽管这些方法更广泛应用于样品中蛋白质变化的定量分析,但是也可以用来定量分析不同生物样品中 P T M 的变化。

定量分析既可以是绝对的, 如浓度或每个细胞拷贝数,也可以是相对地,如不同处理的样品中倍数变化。绝对浓度更加难以获得,但是更有利于分析,并且可以用来衍生相对测量 。 L C -M S /M S 实验中,随着肽段依次从色谱柱上洗脱下来,可绘制肽段信号强度图谱 。对于任何给定的组分,曲线下的面积都与肽段的丰度直接相关,可以进行无标记 (label-free)的量化。然而,肽段的理化性质 ,如疏水性、电荷和大小 , 变化范围非常广 , 这会引起质谱检测器响应的差异。另外,当采用这种无标记方法进行定量分析时,洗脱条件的变化及其他非目的肽段的共同洗脱都会成为问题。使用这个方法测定蛋白质丰度可能与实际丰度相差 3〜5 倍 ( O n g and M a n n , 2005)。

为避免电离效率和 M S-检测器响应相关的问题,可以利用基于稳定同位素稀释理论(stable isotope dilution theory)的方法。这一理论认为,一个稳定的、同位素标记的肽段与其天然类似物化学性质相同。因此,同位素标记和未标记的肽段, 在色谱和 M S 检测中行为一致。由于质谱能够识别标记和未标记形式间的质量差异,因此可以检测相对的信号强(Bantscheff etal. , 2007)。利用稳定同位素稀释理论的策略主要有 4 种 。第 一 ,与 目 的 P T M 相应的同位素标记肽段标准物可以引入到样品中(Gerber et al, , 2003)。第 二 ,细胞在含主要同位素化纯组分的培养基中生长,可以被代谢标记 ( O n g and M a n n ,2005)。第三,在使用蛋白酶,如胰酶水解过程中,同位素可以被整合到肽段中(Miyagiand R a o , 2007)。第四 ,可以通过化学方法将同位素标记的标签连接到特定氨基酸侧链上 (Gygi et al. , 1999; Ross et al. , 20〇 4)。不管选择什么方法,肽段的「重」「轻」形式之间质量差异应最小为 3〜4 D a , 以避免质谱图中峰的同位素重叠。另外,氣化肽段与其「轻」的类似物相比,色谱洗脱时间有所不同(Z h a n g and Regnier, 2002)。这导致需使用更加昂贵的 13C -和 15N -试剂。

运用稳定同位素的最基本的方法称为绝对定量法(absolute quantitation,A Q U A )(Gerber et a l., 2003)。 在这一方法中,将合成的同位素标记肽段作为内标加人到肽段混合物中。 Steve G y g i 和同事利用这个方法确定了非洲爪蟾 (X e n o p w s ) 细胞周期中磷酸化的丰度变化( S t e m m a n n et al. , 2001)。这 个 方 法 需 要 为 每 个 量 化 的 P T M 标记合成肽段 ,因此比较麻烦。标记的磷酸肽内标物易于获得,但并不是所有的修饰都这么简单,这限制了这个方法的广泛应用。内标物通常在蛋白质水解的前后加入, 这样无法标准化消化步骤上游的样品制备时出现的变化。这 一 方 法 还 需 要 对 P T M 有 事 先 了 解 ,从而能够合成相应肽段。也有必要了解修饰肽段的大体丰度,从而能够加人近似量的标记标准物。

为最小化样品制备的误差,细胞可以在不同条件 (含同位素标记或不含同位素标记)下培养,并且在样品制备和分析之前收集细胞。样品制备时的任何误差都会对两种细胞群产生同样的影响。 Mathias M a n n 的实验室发展了这些方法中最流行的技术,称为细胞培养氨基酸稳定同位素标记(stable isotope labeling by amino acid in cell culture,SIL A C ) ( O n g et al., 2002)。在 S I L A C 方法中,培养基中含 13C 6-精氨酸和 13C s-赖氨酸,它们能够标记胰酶酶切位点。因此除去 C 端碎片,每个胰蛋白酶酶切产物都包含一个标记的氨基酸。 S I L A C 法与完全代谢标记法相比优点在于, 整合的标记数是确定的,并且独立于氨基酸序列。这种简易性使得 S I L A C 的数据翻译比使用其他更复杂的标记方法简单 。 S I L A C 最多只能比较 3 个培养条件,分别是未标记、13C ,-标记或 13C 615N 4-标记氨基酸 。 S I L A C 的其他局限性在于它只能用于特定的模式生物,或者是能够在含有确定同位素成分的培养基中生长的细胞系,并且非常昂贵。然 而 S I L A C 的高准确度使得该方法非常适合于研究 P T M (G)Isen et al., 2006)。一个改进的 S I L A C 法利用标记的 S -腺苷甲硫氨酸进行标记,来鉴定并相对定量蛋白质甲基化修饰 (()ng et al. , 2004)。

一种体内代谢标记法的替代方法是体外酶标记法。这种标记方法既可以在蛋白质消化过程中完成,也可以在蛋白质水解后通过额外反应步骤完成。当使用重水(H 218O )时 ,胰蛋白酶或 Glu-C 将会引入两个 18O 原子。生 成 的 4 D a 漂移足以使同位素被分辨,并获得相对定量数据 (Miyagi and R a o , 2007)。然而,一些蛋白酶,如蛋白内切酶 L y t N ,仅引入一个 18O 原子,产生的谱不足以分辨同位素峰重叠 (Raoet al., 2005)。完全酶标记很难达到 ,并且不同肽段引人标记的速率不同,使得数据分析变得复杂 (Ramos-Femandez et al. ,2007)。所以此方法在定量蛋白质组学中没有得到广泛应用 ( O n g e t al., 2004)。

有效的化学标签(chemical tagging) 技术能减轻酶标签方法的某些限制。最早的化学标签法是由 Ruedi Aebe r s o l d 实验室发展的,称为同位素编码亲和标签(isotope-codedaffinity tag,I C A T )(G y g 丨 e t a L , 1999) s I C A T 试剂最初由以下成分组成: 一个靶向半胱氨酸的硫醇反应基团、带 有 〇或 8 个氣原子的一个聚醚连接区 (linker region) 以及为亲和素柱亲和纯化准备的生物素基团。由于氘同位素与其轻形式相比在色谱柱中的行为不同,因此发展了 13C 和 15N附加标签试剂 (Bottari etal. , 2004)。 I C A T 反应在还原环境下进行,利用重或轻 I C A T 试剂将样品化学标记。然后 ,这两个样品混合,并选择一种蛋白酶将其水解。标记的肽段通过 I C A T 组分的亲和标签回收, 并用质谱定量分析。这一方法仅选择含有半胱氨酸的肽段,因此有效简化了肽段混合物。然而大部分肽段不含半胱氨酸残基,并且大部分 P T M 在亲和纯化步骤中被丢弃,因 此 I C A T 并没有广泛应用于P T M 定量分析(Bottari et al., 2004)。

另外一类化学标签策略是利用肽段 N 端和赖氨酸残基的 e•氨基的反应活性。同位素编码蛋白标记法(I C P L )、相对和绝对定量同位素标签法(isot0p e tag for relative andabsolute quantification,i T R A Q ) 及串联质量标签法(tand e m m a s s ta g , T M T ) 都是利用了氨基与特定化学基团的反应活性 (Bottarietal., 2004)。这些方法中最受公认的技术为 i T R A Q , 其引人了等量异位(isobaric tag) 标签, 能够在串联质谱仪中断裂,在 113〜121m/z值处产生了独特的报告离子 ( O n g et al, , 2004)。通过对这些低质量碎片的峰面积进行积分来定量。具备检测低 m /z 碎片离子能力的质谱仪,如 四 极 杆 和 T O F , 通常都可 用 于 i T R A Q 实验。商业化试剂盒允许一个实验检测 8 种状态。由于肽段的标记是等量的 ,因 此 它 们 在 色 谱 分 离 中 性 质 类 似 ,并 且 在 碎 片 图 谱 中 显 示 出 定 量 差 异 。通过i T R A Q 方法,不同样品在不同条件下分离,经胰酶消化后,利 用 i T R A Q 试剂进行标记。随后样品混合,并通过一个 M S /M S 实验进行分析。图 40. 6 展 示 了 一 个 经 4 种 i T R A Q试剂标记后,按不问比例混合而得到的串联质谱图的例子 (Ross et al. ,2004)。至于其他基于质谱的方法,有效的肽段分离非常重要,因为共同洗脱下来的相近质量的肽段也会对观测到的报告离子作出贡献,从而干扰定量分析。离子阱质谱法通常不适用于 i T R A Q分析,因为得到的 M S /M S 数据中,i T R A Q 标签碎片产生的报告离子中的较小的 1/3 会丢失。利用脉冲 q 解离 (pulsed q-dissociation,P Q D )可缓解该问题,但是后者在蛋白质组学中应用有限(Bantscheff et al., 2008; Cunningham et al., 2006; Griffin et al., 2007)。

利 用 i T R A Q 方 法 可 以 比 较 不 同 条 件 下 蛋 白 质 组 的 磷 酸 化 水 平 。 Forest W h i t e 和同事 研 究 利 用 抗 磷 酸 化 抗 体 后 接 I M A C 富 集 ,进 而 i T R A Q 标 记 的 方 法 研 究 表 皮 生 长 因 子(E G F ) 刺 激 随 着 时 间 对 细 胞 磷 酸 化 状 态 的 影 响(Z h a n g etal. ,2005)。这 项 研 究 在 一 次分 析 中 调 査 了 4 个时间点 (0min 、5min 、10min、30mim)。他 们 能 够 量 化 58 个 蛋 白 质 的 78个 位 点 的 磷 酸 化 相 对 变 化 ( Z h a n g et al., 2005)。这 项 实 验 方 法 强 调 了 将 P T M 富 集 与 定量 相 结 合 的 功效 ,能 够 更 加 深 入 地 了 解 细 胞 的 生 物 学 。但 是 很 难 确 定 在 某 一 特 定 条 件 下一 组 肽 段 中 哪 些 发 生 了 磷 酸 化 ,这 是 因 为 未 磷 酸 化 肽 段 与 磷 酸 化 肽 段 在 质 谱 检 测 响 应 中有 差 异 。因 此 , 尽 管 可 以 在 不 同 条 件 下 ,将 未 修 饰 形 式 之 间 进 行 比 较 ,或 者 将 相 同 肽 段 的不 同 磷 酸 化 水 平 进 行 比 较 ,但 是 通 过 生 成 谱 的 报 告 离 子 峰 的 比 值 来 比 较 修 饰 与 未 修 饰 形式 并 不 可 靠 。

目前发展了有限数量的专门鉴定特定 F T M 的附加标签的方法。这些方法利用了化学修饰的氨基酸侧链选择性的化学反应。为了定量分析磷酸化修饰, 磷 酸 的 消 除 以 及随后的乙二硫醇衍生物的 M i c h a e l加成都可用来引人同位素标签 ( Z h a n g et aL , 2003)。阱化学法也可应用于糖基化的肽段, 用同位素标记的标签替换碳水化合物基团。但这些方法仅对少数 P T M 有效。除此之外,如果参与的化学反应并不高效,生成的多肽混合物的复杂程度将会增加。这会导致肽段和相应 P T M 的鉴定出现问题, 也会出现不准确的量化信息。

同位素标记和标签策略可能耗时、繁琐并且成本较高。除了先前讨论的色谱峰积分法 ,也有其他一些无标记定量方法可以用来定量分析 P T M 。这些方法通常会涉及一些形式的谱图计数 (spectral counting)和蛋白质长度的标准化(W a s h b u r n et al. , 2001)。它们是否真正能够进行定量分析仍存在争议, 因此这些方法更普遍作为差异蛋白质组学技术 。谱图计数方法的理论基础是,随着给定样品中某一蛋白质丰度的增加, 能分离出更多来源于该蛋白质的肽段 M S /M S 谱 。通过比较实验组间收集的某一特定蛋白质的谱图的数量可推断出相对的定量分析。这一方法的使用被质疑是由于它并没有直接测量肽段的任何物理性质,并且假定每个蛋白质都发生线性反应 ( B a n t s c h e f f e t a U 2007)。正如前面提到的,肽段的理化性质在一个消化样品中变化范围非常广,以至于它们在色谱和 M S检测器的行为也大有不同。与标记和标签技术相比,这些方法提供了更大的动态范围,最适用于研究样品中大的或球状蛋白质的变化。然 而 ,肽段中不确定线性反应和谱图计数的潜在低准确度都限制了这些方法的广泛应用(Old et al., 2005)。

为了将样品中蛋白质无标记定量分析的变异性最小化, 可以比较多个样品中相同蛋白质的特定肽段或多种肽段。这 推 动 / 选择性反应监测(selected reaction monitoring,S R M )和 P T M 的多重反应监测 (multiple reaction monitoring,M R M ) 技术的发展 ( U n w i net al., 2005, 2009; Williamson et a L , 2006; Wolf-Yadlin et al. , 2007)。在一个 S R M实验中,多个实验组中的单一肽段前体及其碎片离子 m 八值或瞬态 (transition) 被选择性监 测 ,通常使用三重四极杆质谱 (Lange etal., 2008)。要使蛋白质的量化具有较高的统计置信度,通常 在 M R M 实验中检测 3〜5 肽段及其瞬态。这些实验一般使用三重四极杆质 谱 ,因四极杆的第一个和第三个四极杆在分离特定的瞬态时具有高分辨率和高占空比(high duty cycle)。多重瞬态被监测, 随着时间每个特定瞬态都产生一组关于滞留时间和信号强度的谱图。瞬态的积分区域用来定量分析蛋白质。 M R M 能够实现对复杂混合物中低丰度蛋白质的检测,并在高达 5 个数量级的动态范围内产生线性响应 (Lange et al., 2008)。

虽 然 M R M 可以用来选择性监测包含 P T M 的蛋白质(Williamson et al., 2006),然而 ,M R M 缺少鉴定混合物中蛋白质的能力,并且瞬态的选择通常是基于先前的实验数据或文献搜索。瞬态还必须进行优化, 以便能在三重四极杆中的第二个发生有效断裂。尽管计算工具可能会有所帮助, 但是研究还是可能因样品有限而受到限制。另外,三重四极杆 利 用 C I D 断裂肽段,因此不稳定P T M 可能会发生中性丢失。

M R M 的扩展应用包括使用同位素标记的合成肽(过程类似于 A Q U A )来完成肽段绝对定量分析(W o l f-Y a d l i n e t a l., 2007)。总之, 这种质谱中新出现的技术非常有潜力,能够为多种生物样品提供蛋白质和 P T M 的定量分析信息。



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