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IgG的分离与提纯实验_硫酸铵沉淀法

2019.4.06

IgG的分离与提纯实验可以用于：制备酶标抗体或荧光抗体。

实验方法原理	硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。
实验材料	动物血清样品
试剂、试剂盒	硫酸铵 NH4OH PB液 BaCl2溶液纳氏液洗脱液生理盐水
仪器、耗材	透析袋离心机烧杯搅拌棒
实验步骤	一、材料与试剂配制 1. 动物血清 2. 硫酸铵饱和溶液硫酸铵：800 g~850 g H₂O ：1 000 ml 加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28% NH₄OH调pH至7.0（不调pH值也可以）。注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H₂S，静置过夜后滤过，加热蒸发H₂S即可。 3. 0.01 mol/L pH7.4 PB液 A液：0.10 mol/L NaH₂PO₄液 NaH₂PO₄·2H₂O ：15.60 g 加H₂O至1 000 ml B液：0.10Mol/L Na₂HPO₄液 Na₂HPO₄·12H₂O： 35.80 g 加H₂O至1 000 ml 取A液19 ml，B液81 ml加水至1 000 ml即可。 4. 1%BaCl₂溶液 5. 纳氏液 HgI ：115.00 g KI： 80.00g 加H₂O至500.00 ml 溶化后过滤，然后再加20%NaOH 500.00 ml，混合即可。 6、0.50 mol/L的HCl液和0.50 mol/L的NaOH液 7、洗脱液 0.03 mol/L的NaCl液。 8、透析袋（或玻璃纸）二、操作方法 1. 取20 ml血清，加生理盐水20 ml，再逐滴加入（NH₄）₂SO₄饱和溶液10 ml，使成20%（NH₄）₂SO₄溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置30 min。 2. 3 000 r/min离心20 min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。 3. 在上清液中再加（NH₄）₂SO₄饱和溶液30 ml，使成50%（NH₄）₂SO₄溶液，充分混合，静置30 min。 4. 3 000 r/min离心20 min，弃上清。 5. 于沉淀中加20 ml生理盐水，使之溶解，再加（NH₄）₂SO₄饱和溶液10 ml，使成33%（NH₄）₂SO₄溶液，充分混合后，静置30 min。 6. 3 000 r/min离心20 min，弃上清，以除去白蛋白。重复步骤5，2~3次。 7. 用10 ml生理盐水溶解沉淀，装入透析袋。 8. 透析除盐，在常水中透析过夜，再在生理盐水中于4℃透析24 h，中间换液数次。以1%BaCl₂检查透析液中的SO₄^2-或以纳氏试剂检查NH₄ （取3~4 ml透析液，加试剂1~2滴，出现砖红色即认为有NH₄ 存在），直至无SO₄^2-或NH₄ 出现为止。也可采用SephadexG25或电透析除盐。 9. 离心去沉淀（去除杂蛋白），上清液即为粗提IgG （即γ球蛋白，如以36%的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球蛋白，Euglobin，含γ球蛋白）。 10. 过DEAE－纤维素层析柱。以0.01 mol/L pH7.4 PBS（0.03 mol/L NaCl）洗脱，收集洗脱液。也可采用SephadexG150或G200柱。 11. 蛋白质及其定量鉴定。 12. IgG的纯度鉴定可采用下列方法之一鉴定。（1）区带电泳玻片琼脂或醋酸纤维膜电泳均可。加样电泳后，只在γ—球蛋白的迁移部位出现一条带。操作时，同时可用全血清样品，不同浓度（NH4）2SO4盐析样品进行电泳，以资比较。（2）琼脂双相双扩散鉴定预先准备该IgG免疫异种动物所获的抗IgG血清。将IgG与抗IgG血清进行双相双扩散，如IgG提纯的话，则在两样品孔之间出现一条沉淀线。（3）免疫电泳鉴定孔内加待测样品，电泳后，在槽内加抗IgG血清，琼脂扩散24h，观察结果。如果提取的IgG纯的话，则只出现一条弧形的沉淀线，且沉淀线位于γ—球蛋白区。此鉴定必须同时进行全血清及抗血清抗体的免疫电泳，以资比较。（4）圆盘电泳鉴定用全血清样品及提纯样品同时进行圆盘电泳。全血清样品在圆盘电泳上出现数十条区带，而纯化的IgG则只有一条区带。 13. IgG的浓缩与保存（1）IgG的浓缩（2）IgG的保存一般浓缩至1%以上的浓度，再分装成小瓶冻干保存，或加0.01%硫柳汞在普通冰箱或低温冰箱保存，注意防止反复冻融。展开
注意事项	一般浓缩至1%以上的浓度，再分装成小瓶冻干保存，或加0.01％硫柳汞在普通冰箱或低温冰箱保存，注意防止反复冻融。
其他	纯化IgG小量几十ml的话，用protein A或protein G就可以，疏水柱等也可以纯化；大量的话，上百ml，可以使用streamline protein A。之前根据载量估计一下需要的柱子体积。