蛋白质浓缩和溶质的去除实验
蛋白质浓缩和溶质的去除实验
| 实验步骤 |
一、层析
在过去的 2 0
年中，蛋白质组学技术的日益广泛应用，使蛋白质浓缩和脱盐的层析技术得到不断革新。蛋白质组学通常需要从少量复杂的混合物中富集蛋白质，包括选择性地浓缩特定种类的蛋白质。由于质谱
(M S )
和基于抗体检测技术的高灵敏度及可提供详细生化特征的性质，它们在临床诊断、生物药物鉴定以及蛋白质结构与功能的基础性研究等广泛的应用中具有很高的实用性。这些应用需要分析生物体液中含量很低的药物靶标
1 凝 胶 过 滤
凝胶过滤基质已经被广泛应用于在非变性情况下蛋白质的脱盐。与小分子物质不同，大分子蛋白质不会进入这些树脂的小孔中，从而在流动过程中将盐分除去。通常情况下
，填料体积是样品体积的 4〜2 0 倍, 同时柱长与柱径的比值在 5〜1 0 时, 层析柱的分辨率最佳。在脱盐的过程中样品最少被稀释 1. 2
5 倍 ，但是，如果选择合适的洗脱剂，即使样品浓度在 ug/m L 的范围内，其损失也可以说是微乎其微。由不同商家提供的基于多聚糖
2 离 子 交 换 层 析
凝胶过滤蛋白质脱盐的一种替代方法是使用混合床离子交换 (IE X ) 树 脂 。大尺寸颗粒和表面修饰的混合床 IE X
吸着剂可以有效地捕捉小分子阴离子和阳离子(＜1000
Da),最小限度的截留高分子质量的蛋白质分子。脱盐可以通过分批处理模式来实现，或通过一个基质填料床来实现。然而 ，这种技术一个不良的后果是:
在常规 IEX 吸附剂的混合床发生的离子交换可引起蛋白质样品的酸化和沉淀。相比之下，用于牛奶和乳清脱盐的
3 反 相 层 析
反相 (R P ) 层析是分离、脱盐和浓缩蛋白质的一项很流行的技术, 一定程度上是由于样品被浓缩在小体积的可通过蒸发而去除的挥发性溶剂中。伴随着常规分析方法—质谱 (M S) 的到来，各种各样的反相提取形式被商业化，以提高质谱技术操作过程的速度和便利度。这些形式包括微型离心柱、毛细管、微量加样器吸头和微孔板，用于对样品量低至飞摩尔(femtomole) 级的蛋白质进行快速脱盐，并洗脱在微升级体积之中。通常情况下 ，在 p H < 4 和有离子配对剂（如 〇.1 % 〜I.0 % T F A )存在的情况下可使蛋白质和纯化柱中的胶实现最佳结合。有机组分的存在可能会促进蛋白质与纯化柱中的胶可逆结合，一般 为 15 % 的乙腈或甲醇，或离液剂（如盐酸胍)等。如果含有去污剂类污染物，则可能需要对样品稀释以防止其干扰蛋白质与吸附剂的结合。脱盐操作需要对树脂进行清洗, 如使 用 5 % 的甲醇、1% 的 T F A 等; 通过用可替代的离子配对剂进行实验可能会达到有选择的洗脱。要根据蛋白质的大小对反相吸附剂进行选择, 通常使用脂肪族的 C 4 、C 8、C 1 2 和C 18化合物。基于微量移液器的产品的一个例子是ZipTips (Millipore， Billerica, M A )，它用反相树脂颗粒或N u T i p s (G l y g e n , C o l u m b i a, M D )填充, 吸头的内壁用结合材料包被 ，因此减轻了反压力, 将样品与吸头表面的非特异相互作用减少到最小。为了同时对多个样品进行高通量脱盐, 也可以将反相树脂置于 9 6 孔板中，其中一个例子就是 ZipPlate模式 (Millipore， Billerica， M A )。
4 疏 水 和 亲 和 层 析
除了常用的凝胶过滤、离子交换和反相吸附剂，可用的其他材料, 如分批的或置于微型设备中的树脂可以支持多种模式的层析,
用于蛋白质的浓缩和脱盐。这些包括疏水、亲水
、金属螯合、蛋白质亲和树脂。值得注意的是，当蛋白质样品悬浮于一种有机溶剂并且需要去除污染的盐分或去污剂的时候，亲水介质为反相层析提供了一个有用的替代品。例
如 ，PAGE-P r e p 介质（T h e r m o /Pierce， Roc k f o r d, I L)，当蛋白质在5 0 %
二甲基亚讽存在的情况下与树脂结合时，它 可 用 于 SDS-PAGE 分析前蛋白质的脱盐。另 外 ，Glygen(Columbia， MD)
提供了微量移液器滴头形式的亲水介质 (N u T i p
)。类似于反相介质，亲水性树脂的潜在缺点是蛋白质常常以变性的形式收回。相比之下，更重要的是固定化金
使用高效液相色谱(H P L C )技术为质谱(M S )分析准备蛋白质样品的常规操作,
推动了供应商们去提供它们的吸着剂，成系列的柱子、套筒和毛细管等不断出现并持续增加。这反过来又允许通过使用柱切换程序使样品制备流线化。这种方法先用一个短的预装柱进行蛋白质样品的快速浓缩和脱盐，接着可以通过使用一个长柱，在
同 样 的 H P L C 系统对蛋白质进行高分辨率的分离。例如 ,P e p M a p 微量预装柱(Dionex，Sunnyvale,
CA ) 可用于蛋白质样品的快速浓缩和脱盐，其填充床的长度仅为5 m m 。由于树脂使用的可选择性
，分析物的捕集效率由选择的填料所支配，而样品体积的减少改善了随后层析步骤的分辨率。在此背景下，同样值得评论的是，整体分离材料正被越来越多地用于对蛋白质的浓缩和脱盐
(Schley et al., 20〇 6)。高 达
20um的有效孔径允许溶质快速传递透过整体基质。相比较于在基于颗粒吸附剂的亚微米级孔隙内实现的由较慢的扩散作用所介导的液相传质，整体介质可以实现在高流速低反压力条件下的高效分离，特别有益于通过柱切换进行快速脱盐。然而
，在一个更直接的方法里，Mass-Prep c o l u m n (Waters ， Milford，M A
)已被用于对疏水性基质中蛋白质的在线脱盐, 样品可直接注人E S I 质谱仪中( W h e a t
5 生 产 规 模 的 层 析
类似于分析用的小规模提取，制备规模和生产规模的蛋白质回收往往包括浓缩和脱盐
。柱层析仍然是蛋白质纯化的核心技术，这归因于其可实现的高选择性，同时具有方便耐用的填充树脂床，原料在树脂中通过流动而进行传送。商业化生产酶和生物药品通常需要加工数千升的初始原料。为了尽量减少操作的复杂性，减少加工时间，同时有效的控制成本，可能有必要在下游操作过程的早期对原料进行浓缩，去除大部分杂质和不必要的盐分。这可以通过使用直径达2
m 的大的树脂层析柱床经结合-洗脱层析来实现, 其产生
二、电泳
通 过 凝 胶 电 泳 进 行 蛋 白 质 浓 缩 通 常 应 用 于 其 随 后 的 分 析 技 术 中 ，用 以 增 强 灵 敏 度
。例 如 ，蛋 白 质 印 迹 法 (Western Blot) 的 灵 敏 度 可 通 过 应 用 高 达 250 uL 的 蛋 白 质 样 品
，在微 型 凝 胶 系 统 1〜 2 cm 的 积 层 胶 上 连 续 进 行 5 次 以 上 的 加 样 而 得 到 增 强 (Sheen
and AliKhan, 2005)。这 种 方 法 可 实 现 有 效 的 样 品 浓 缩 ，垂 直 谱 带 增 宽（band
broadening) 是它唯 一 的 人 为 痕 迹 。在 Western B lo t 之 前 对 稀 释 样 品 进 行 类 似 的 浓 缩
可 通 过 一 个 漏 斗 状的 上 样 孔 来 完 成 。毛 细 管 电 泳 法 (CE) 可 通 过 堆 积 作 用 而 实 现 蛋 白 质
样 品 的 浓 缩 (参 见
三、透析
透析是基于分子质量大小的液相分离技术，它由透过半透膜的选择性扩散来实现。这种技术被认为是从大分子蛋白质中去除小分子溶质的最流行方法。特别是，这种非变性的脱盐技术允许在良性或生理条件下更换缓冲液，其影响目标蛋白质性质的风险可降到最低限度。
过去的十年里，透析的原理并没有改变，但用于透析的技术和工具却得到了改良。尤其 是 优 化 的 技 术 实 现 了 高 通 量（减 少 处 理 时 间 ），增 加 了 处 理 样 品 体 积 的 灵 活 性（从1 0 uL 〜 100 m L ); 改进了的透析膜形态减少了蛋白质的吸附和损失，提高了样品处理的方便性。
通常情况下，目的缓冲液
(透析液）的体积要比蛋白质样品的体积大若干个数量级。样品被转移到一个密封舱内，暴露于充当半渗透屏障的透析膜。透析膜通常具有特定的孔径,
即截留分子质量 (M W C O )，它允许分子质量小于这一限度的分子双向自由通过，而大分子物质 (如蛋白质)
则被截留。透析膜两边的缓冲液浓度梯度驱动溶质从浓度高的区域向浓度低的区域扩散 (图 9. 1)。扩散运输的流量可以用菲克扩散定律来描述。
有几个方面可以影响透析产品的稳定回收, 包括缓冲液交换所需的时间、透析系统的设计以及透析膜的化学和形态学特征。完成缓冲液交换所需要的时间取决于几个因素。可以通过提高分子穿过半透膜的固有扩散作用以减少透析过程的时间。基于前述的方程 ，物质转运可以通过增加膜面积或溶质的流量而得到提高。当样品体积很小时, 可以很容易的得到样品相对于透析液的一个很大的比率。然而, 蛋白质可吸附到透析膜而导致损失。在这样的背景下，需要评价增加膜面积或增加时间 (对于较小的膜面积) 所产生的影响。由于溶质的扩散系数随温度而变化，温度升高将加快分子运动，增加内在的扩散系数 ，从而导致更快的转运。然 而 ，升髙温度会对样品的稳定性产生不利的影响。由于样品的完整性往往是最重要的，因此可能需要预先确定能保持蛋白质稳定的最高温度。
透析系统的设计也可以决定进行有效透析的时间和产品回收的效率。溶质从样品中穿过膜扩散进入透析液的边界层。边界层中溶质的浓度髙于透析液中其他部位溶质的浓度 ，从而减少跨越膜的浓度梯度，抑制扩散的进行。然而 ，可通过介导透析液的对流流动或通过不停的搅拌来减小边界层。
当前，透 析 膜 和 透 析 管 的 机 械 设 计 使 其 可 以 对 范 围 广 泛 的 样 品 量（从 10 uL 〜100 mL)
进行加工处理, 其产品的损失可以忽略不计。传统的透析管在其可使用之前要经历复杂的准 备 。 Pierce Biotech (Rockford，
IL) 提 供 的 SnakeSkin®透析管可以简化大体积样品的透析。这一技术的核心为褶状的再生纤维素膜 (3. 5〜 10 kDa M W
CO)，便于快速 准 备 。在小体积样品透析的情况 下 ， Pierce 提 供 了 简 洁 的 SlideA-Lyzer®微型透析
1 浓 缩 和 亲 和 结 合 的 应 用
蛋白质缓冲液交换的应用主导了透析膜的使用。然而 ，透析技术在浓缩和大分子亲和结合相互作用领域的应用越来越多。
使用透析膜进行蛋白质的浓缩类似于双水相萃取，通过使用试剂（ 如聚乙二醇、葡聚糖等聚合物) 产生一个双相系统, 而透析膜则将这个两相分开 (Waziri etal. ， 2004)。根据该系统的设计，蛋白质可以自由的通过膜并与沉淀剂相互作用，随后得到浓缩，同时产品也得以回收。
这项技术被称为平衡透析,
它也被用于在血清结合测定中对候选药品的鉴定，研究抗原-抗体相互作用，以及评估使用其他方法无法检测的低亲和力相互作用。在平衡透析中，膜的选择需要满足以下条件:
所需的蛋白质或配体可以自由通过; 受体分子只能位于膜一边
，且不能透过。当蛋白质扩散穿过膜时，其中的一些蛋白质将结合到受体上，而有些蛋白质则仍保留在溶液中。配体穿过膜并结合到受体上的扩散作用会持续进行，直到达到平衡。
四、超滤
超滤 (U F ) 所利用的分离机制本质上相当于透析。两种技术都采用半渗透屏障或膜将样品 (包含有所需的产品或溶质)
从溶液中分离开来。膜的设计允许小分子质量的溶质(如盐)
渗过，而所需的产品则完全保留下来。超滤膜非常适用于浓缩生物制剂，因为它们可以在一个较宽的温度范围 (2〜26°C )
内操作，而且不涉及相变化或化学添加剂，从而最大限度地减少了不稳定生物制品的变性和/或降解。将超滤与透析区分的作用有 3 个:①
一 般 情 况 下 , 有
3 种 模 型 方 法 已 被 用 于 描 述 通 过 超 滤 进 行 溶 质 转 运 的 真 实 机 制(Denisov， 1994)。其 中
的 一 种 超 滤 转 运 机 制 如 图 9. 2 所 示 。由压力 驱 动 的 液 流 促 使 溶质 和 溶 剂 向 膜 的 上 游 表 面
传 递 并 透 过 ，所施加 的 压 力 差 被 称 为 跨 膜 压 力（△P tm ) 。如 果 膜可 以 完 全 保 留 住 一 个 给 定 的 溶 质（如 蛋 白 质），就 如 同 通 过 超 滤 进 行 浓 缩 的 情 况 一 样 ，C 滤出液=0,
保 留 下 的 溶 质 将 在 膜 的 上 游 表 面 积 累 ，将 导 致 膜 表 面 在 边 界 层 厚 度 δ 内 的 浓 度增 加
。这 种 现 象 称 为 「浓 度 极 化 “(concentration polarization)。 溶 质 在 膜 表 面 的 积 累 会
通过 几 种 机 制 影 响 溶 剂 过 滤 通 量 (J v) 。首 先 ，积 累 的 溶 质 可 以 产 生 一 个 沿 着 膜 的 渗 透
压 力差 ，驱 动 液 流 从 滤 液 向 原 料 或 渗 余 物 的 方 向 流 动 ，从 而 减 少 溶 剂 运 输 的 净 速 率 。对
通 量 的描 述 见 下 文和图 9. 2。
总 体 而 言 ，这 些 模 型 可 以 让 用 户 更 好 地 了 解 超 滤 工 艺 参 数 对 溶 质 和 溶 剂 流 量 的 影 响 ，并 可 以 依 此 优 化 条 件 来 提 高 膜 的 通 量 。这 些 模 型 最 重 要 的 应 用 可 能 是 开 发 设 计 可 进 行 大规 模 浓 缩 的 超 滤 系 统 ，对 昂 贵 的 产 品 (如 用 于 疾 病 治 疗 的 蛋 白 质 ) 进 行 浓 缩 ，在 此 ，浓 缩 工艺 的 生 产 力 和 回 收 率 都 是 至 关 重 要 的 。而 对 于 实 验 室 规 模 的 超 滤 , 这 些 因 素 不 是 最 关 键的 ; 但 在 用 于 小 规 模 制 备 的 超 滤 系 统 的 设 计 中 应 该 考 虑 这 些 因 素 。
1.超滤膜
一 般 情 况 下 ，大 多 数 超 滤 膜 包 含 一 个 坚 固 的 支 撑 结 构 (如 T y v e k ® ) ，并 在 这 一
基 础
上附加了一个非常薄的聚合物层。实际上正是这一薄层提供了选择性通透膜所需的性质，并决定了流阻。用于超滤的膜的生产技术在过去几十年里都没有改变。然 而
，在膜孔径分布、膜形态和膜修饰等的控制技术方面已经有了显著的改善。超 滤 膜 的 3
个主要铸造技术分别是空气铸造、浸渍铸造和融化铸造。它们的区别主要在于去溶剂化的方法和设备上 ( Z e m a n and Z y d n e y
, 1996)。目前的膜成分可以适应多种聚合物，这些聚合物可以通过接合、融合、涂敷等方式与超滤膜形成共聚物，从而提高了化学和机械稳定性。纤维
2. 超滤装置
如前所述，目前的超滤膜和相关的设备可用于溶质或缓冲液交换，并对所需蛋白质进行浓缩。绝大部分小规模的超滤膜设备设计成盲端操作的模式，而大规模的超滤系统采用切向流操作模式(图 9. 3)。
于漏斗中，在真空作用驱动下透过膜进入到收集容器中。
(3) 离心式过滤器 膜 盘 放 置 于 小 的 离 心 管 中 ，渗透物收集于膜下管底部的空间里。样品通过离心力驱动穿过超滤膜，浓缩了的样品保留于膜上部。 Pall Corporation 提供了宽滤过范围的离心式超滤膜 (N a n o s e p® 、MicroSep™ 、M a c r o S e p® 和 J u m b o - Sep™ ) ，用于处理小 于 I m L 到大 至 60 m L 的样品，它们包含有 O m e g a ™ 改 良 的 P E S 膜 ，其截留分子质量 (M W C O ) 为 10〜100 K 。 Millipore 公司提供了一次性的Centriplus® 离心式过滤设备 ，通 过 A m i c o n 的低吸附性亲水膜，用 于 2〜15 m L 样品的浓缩（100 倍) 和脱盐。这些装置设计可用于能容纳 50 m L 离心管的大多数离心桶式的或固定角度转头的离心机。最后指出，Millipore 公司 的 A m i c o n Ultra-4 离心机过滤器，它们被设计成能够精确的浓缩 (80〜100 倍) 小体积 (1〜4 m L ) 样 品 ，可以用于处理和回收非常宝贵的生物制品。
(4) 多孔滤板超滤膜整合至 9 6 孔 或 384 孔的多孔过滤板中，用于小样品量 (80〜300 uL) 的 高 通 量 浓 缩 或 缓 冲 液 交 换 。系 统 可 设 计 为 包 含 各 种 分 子 质 量 筛 截（1 〇 〜100 k D a) 的膜，并具有高于9 0 % 的回收率。板的构造模式消除了横向流和孔间混合，并包含有出口末端和防溅罩, 以确保清洁的滤液回收。 PaliCorporation 提供了 9 6 孔 或 384孔滤板形式的 T h e AcroPrep™ 滤板 (Pall Corporation, M e r i d e n, C T )。
(5) 搅拌单元装置将平板超滤膜盘放置于一个合适的支撑板上，并密封于圆柱形外壳的底部。根据设计，设备中的液体通过悬挂于顶部的一个磁力搅拌棒进行搅动，使用空气作为压力驱动液体进行超滤。 Millip0r e 公 司 和 Sterlitech 公司都提供了各种规格的设备 ，处 理 的 样 品 量 为 3 〜 400 m L 。这 些 设 备 的 设 计 使 用 了 不 同 的 超 滤 膜 来 模 拟横向流/切向流过滤。
尽管以上介绍的前 4
种设备可能是最易于操作的，并能对很小体积的样本进行处理，然而它们缺少针对膜上的浓缩或浓差极化进行精确控制的设计。相比之下，由于具有搅拌功能，且具有可同时进行缓冲液交换和产品浓缩的能力,
搅拌单元设备具有改良的传质功能和对浓缩的控制能力。使用超滤进行缓冲液交换的过程被称为渗滤（ diafiltration)。
在渗滤过程中，用于交换的缓冲液在过滤的过程中加入到滞留物或进料中，当过量的液体滤过膜时，能渗过超滤膜的缓冲液成分从原料中被移除。相比于通过膜两边溶
3.纯化应用
超滤膜及超滤系统技术的最新进展将超滤的应用由浓缩和缓冲液置换扩展到其他更加复杂的生物分离领域。相 比 较 于 传 统 的 结 合 脱 柱 层 析 ，这些新型的基于膜的「纯化」应用已经被它们的低运行成本和易于使用的优点所推动。最近的研究表明，可以利用静电相互作用来提高传统的基于颗粒大小的、基于膜的处理方式的性能, 这种方法被称为高性能切向流过滤 (Sakena and Z y d n e y ， 1994; van Reis et al. , 1997)。这些膜旨在通过利用分子和膜孔间的静电相互作用，对那些大小相同但等电点不同的生物分子加以分离。此外，在膜色谱领域 (或亲和膜色谱），使用具有较大孔隙范围的膜 (微孔过滤膜） 比使用超滤膜具有明显的优势。膜吸附已被接受作为一种替代的方法用于最终的精制色谱步骤来去除痕量杂质 (G h o s h ， 2002)。有多种商业化的以阴离子或阳离子交换的形式起作用的吸附剂可从 Sartorius 公 司和 Pall 公司获得，与基于凝胶颗粒的色谱不同，这些吸附剂的设计使之可以克服相关的扩散传质限制。通常情况下，带电的配体固定在膜孔中，对流流动使溶质分子极为接近配体，从而最大可能的减少了扩散限度。虽然膜吸附具有高通量的优点和实现高生产率的可能性，但这一技术的应用进展一直非常缓慢，因为膜色谱的结合能力比传统的树脂色谱要低，从而导致它在实际应用中受到限制。
五、冷 冻 干 燥
溶液中溶质的浓缩可以从热力学上通过驱使溶剂变成气态进人顶部空间 (蒸发) 或煮沸而实现。不幸的是，不稳定的溶质(如蛋白质分子)可以被用于除去溶剂所需的热量快速降解。由于溶液的沸点是溶液的蒸气压等于大气压 (顶部空气压力） 时的温度，因此，通过增加溶液的温度或通过降低大气压力 (如采用真空) 都可以使溶剂沸腾。其中后者被称为真空浓缩 ( v a c u u m concentration)。在冷冻干燥的过程中，样品的温度比溶液的凝固点要低 ，溶剂通过升华而被去除。冷冻和真空可同时进行，热量和顶部的空气此时被除去，从而对感兴趣的产品进行浓缩。将要被冷冻干燥的液态蛋白质产品通常含有生物活性成分 、溶剂体系和几种膨胀剂及稳定剂。膨胀剂为活性分子提供支撑结构，而稳定剂则在冷冻干燥之前和样品重新组成之后的液态形式下，对目标蛋白质活性的维持发挥重要的作用 。冷冻干燥一般分为 3 个主要的步骤 （Costantino and Pikal， 2004;Jennings, 1999;Przic et al.， 2004)
（1） 冷冻冷冻速率会影响最终产品的质量。例如，慢速冷冻会导致大冰晶的形成,它会加快冷冻干燥的速率，但可能会使不稳定的蛋白质变性。相反 ，当样品冷冻快速进行 ，会形成小的冰晶，它会使冷冻干燥速率降低，但却能保护蛋白质的稳定性。
(2) 初 级 干 燥 在 初 级 干 燥 过 程 中 ，通过升华作用, 大于 8 0 % 的溶剂从固态直接变为气态。残留的溶剂以湿气的形式仍然吸附在产品上。类似于冷冻速率，干燥速率会影响冻干「蛋糕」的结构和形态，所设计的速率要避免样品融化。
(3) 二 次 干 燥 在二次干燥中，溶
剂残留的吸附降低到足以抑制微生物生长或化学反应发生的潮湿水平，但同时仍保持了冻干产品的活性和完整性。产品的物理性质决定了二次干燥的可持续时间。例如，蛋白质通常需要残留水分的存在以维持结构的完整性和生物活性。必要残余水分的量因产品而异，必须凭经验而定。
图 9. 4 总结了冷冻干燥器的主要组成和操作过程。尽管冷冻干燥机的设计因操作规模的不同而有所差异，然而其主要部件和系统需求并没有改变。过去十年来的创新提高了所有的不同规模冷冻干燥装置的效率、成本效益、准确性和便利性。这些改进因计算机控制的自动化而被增强。特别是，自动化的样品装载/卸载系统通过最大限度地减少用户的手动操作使这一过程更加精确。增 强 型 实 时 过 程 控 制 和 监 测 的 应 用 ，如 S M A R TFreeze Dryer™ Temperature Monitoring 技术（SP Industries， Warminister， P A ) 允许在关键的冷冻干燥周期改善温度控制。例如 ，核磁共振技术 (N M R ) 通过无创的、无接触的重量检测技术取代了传统的称量技术。
尽管有这些改进，在冷冻干燥过程中固有的局限性依然存在。最困难的挑战之一是实现特定产品的目标含水量。当残留溶质-结合水在二次干燥过程中从产品中被去除时，过度干燥会导致产品稳定性降低。未来的冷冻干燥系统将结合精确的监控系统，使用改进的过程质量流量计技术，精确监控冷冻干燥循环中水分的移除。
与当前提高了性能的中试规模的和大型的冷冻干燥器相称的是，已发展的实验室规模系统可以处理相对小的样品体积。 S P Industries 公司、L a b c o n c o 公 司 和 Martin Christ公司专攻实验室规模系统的开发。新的台式系统为通过干冰进行冷冻干燥提供了简单而经济的设备。例如 ，特殊的系统配备一个中心井用于提供干冰和溶剂，它可以作为水蒸气收集器和方便的预冷棺。烧瓶、血清瓶和安 瓿 浸 入中心井并在里面旋转而被冻结。此外，紧凑的台式冷冻干燥机被设计为具有快速的干燥速率，它无限制的蒸汽通道、更高效的冷凝器以及具有阀门的多出入口复合管路等设计使得其工作效率达到最大。总体而言，当前及未来的实验室和商用的冷冻干燥器正被设计成包含有微型处理器控制的形式，以减少操作错误，最大限度地减少手动操作，提高整体系统的性能。
六、沉淀
沉淀是一种常用的纯化技术, 用于蛋白质的浓缩和脱盐。蛋白质沉淀是通过加入某种试剂来改变蛋白质的溶解度，从而将蛋白质从一种溶液中以固体的形式分离的过程。蛋白质沉淀问题将在第 2 0 章中详细讨论。沉淀操作通常成本低廉，易于放大。此外, 大部分沉淀往往在包含有 DNA、脂类和杂质蛋白质的初始料液中进行。有多种方法或系统可用于进行沉淀操作。该项操作的难点是如何确定可完成预期目标的最适方法。沉淀反应可以通过加人中性盐、有机溶剂、非离子型亲水聚合物、多价金属离子等来诱导，或通过加人酸或碱来进行等电点沉淀（Harrison etal. ， 2003)。影响蛋白质溶解度最重要的因素是结构、大小、电荷和溶剂 (Ladisch, 2007)。一旦蛋白质沉淀, 便可以将之通过随后的离心或过滤从溶液中分离。沉淀可以重新溶解到较小体积的溶液中从而达到蛋白质的浓缩 ，或经洗涤并重新溶解到新溶液中以改变溶液的条件。
有 许
多 市 售 的 滤 板 或 管 可 以 以 9 6 孔 板 的 形 式 使 用（A n a c h e m ， U K ;
MilHpore，Bedford, M A ; Pall, M e r i d e n, C T ),
它们的使用可以实现以最小量的资源来筛选沉淀条
使用丙酮进行蛋白质沉淀可以通过向蛋白质样品中加入 4 : 1 的冷丙酮（一 20°C )
来完成。然后进行混合、离心，并将上清液丢弃。这一过程可以重复以更好地去除盐类和其他杂质。随后将沉淀物干燥并重溶于目标缓冲液中。一个类似的操作是将
9 : 1 体积的冷乙醇 (-20°C) 加人到蛋白质样品中。使用乙醇的一个优点是它的易燃性小于丙酮。 Wessel和 Flugge
(1984)提出了一个氯仿-甲醇沉淀系统, 提高了对稀蛋白质溶液的回收率。TCA
沉淀法被认为是一种将蛋白质从稀溶液中沉淀的非常有效的方法。向蛋白质样品中加人同等体积的 2 0 % TCA，冰 浴 30 min。 4°C
离心，弃去上清液。然后将片状沉淀物用冰丙酮 (一 20°C) 洗涤，4°C 再次离心, 弃上清液，干燥。沉淀物可以用目标缓冲液溶解
。可能需要额外的丙酮洗涤或中和重新溶解的样品，以降低酸度，有利于进一步的分析
在许多情况下，实验者希望在沉淀操作后蛋白质的活性和结构仍可以保留。该目标可以通过向蛋白质样品中加入中性盐(盐析) 或亲水性非离子型聚合物 (如聚乙二醇) 来实现 。 Hofmeister (1887;1890) 首先描述了使用中性盐沉淀蛋白质的方法。最常用的盐是硫酸铵，因为它水溶性极高, 并对蛋白质的生物活性无有害作用。硫酸铵沉淀通常是通过缓慢地将饱和硫酸铵溶液 (41. 22 g/100 g 水 ,25 °C ) 加人到蛋白质样品中以达到所需要的浓度来完成。不同的蛋白质在硫酸铵中的溶解度有很大的差异，所以 ，通过预实验来确定目标蛋白质从溶液中沉淀时硫酸铵的浓度可能是非常有益的。蛋白质的这一特性使得将一种蛋白质从其他蛋白质和污染物中通过分步沉淀而进行纯化的设想成为可能。亲水聚合物, 如聚乙二醇 (PEG) 也可以用于沉淀蛋白质而同时保留蛋白质生物活性。使用相对分子质量大于 4000 的聚乙二醇更易于进行蛋白质的沉淀。 Atha 和 Ingham (1981) 论证了使用浓度为 3% 〜30% (w /V )的 PEG 4000 对几种蛋白质的沉淀情况。
七、结晶
结晶是另一种纯化技术，它类似于沉淀作用，可用于蛋白质的浓缩和脱盐。蛋白质结晶是一个强大的分离技术，因为它可同时浓缩、纯化和稳定蛋白质产品 (Etzel， 2006)。结晶是一种在水溶液中受控制的沉淀，主要 有 4 个变量可用来控制结晶的形态和回收: 蛋白质的浓度、沉淀剂的浓度、pH 及温度。结晶类似于沉淀，都是从溶液中形成固体颗粒; 但沉淀具有不确定的形态，呈现出小颗粒特征，而结晶是髙度有序的，通常呈现出较大的颗粒 。多孔板和小型化的高通量筛选系统正被开发，它们与自动化液体处理方法及新型的分析方法相结合，使得对纳升 (nanoliter) 级样品进行宽范围结晶条件的快速筛选成为可能 (Brown et a l,， 2003)。 此 外 ，微流体芯片的应用已被发展用于生物分子的结晶（Tera-genics, Watertown, M A)。 实际上，对一个蛋白质进行结晶比对其沉淀往往更加困难，为了进行蛋白质的浓缩和脱盐，沉淀往往是一种更常用的办法。此外，当结晶过程被从实验室水平放大时，混合的力度可显著影响晶体的稳固性。
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