人血浆中缓激肽的SPE LC-MS/MS定量检测方法（四）

预分析收集和处理的重要性
对血浆中的缓激肽进行准确定量十分困难，因为缓激肽可以在采血和样品制备中经蛋白水解过程而生成^1,6,7。本研究特别注重血液收集方案，通过添加蛋白酶抑制剂以防止体外缓激肽的形成。在图6中，A图和B图显示出，如果采用同一供体和相同的收集方案，将血液收集到分别添加和未添加蛋白酶抑制剂的EDTA试管中，缓激肽的浓度从90 pg/mL升至250 pg/mL。通过使用来自供应商的另外两个供体的未指定样品收集方案，缓激肽的人为形成得到进一步证实，如图6（图C和图D）所示。在上述情况下，将血液样品收集到不含蛋白酶抑制剂的EDTA试管中，浓度达到了较高的ng/mL水平。这些结果进一步证明了合适的样品收集方式对于准确定量内源性缓激肽血浆浓度的必要性。

结论
本研究开发了一种用于提取人血浆中缓激肽的混合模式SPE提取方法。μElution SPE提取板消除了蒸发操作需求，并且利用非特异性结合和样品浓缩而大大降低了损失的可能性。通过一种快速、简单、分析级的LC方法将缓激肽与相似度很高的内源性干扰物分离开来，LC总运行时间仅为3.5分钟。与传统的C₁₈全多孔色谱柱相比，CORTECS UPLC C₁₈实心核颗粒色谱柱改善了峰形，提高了缓激肽检测的灵敏度。CORTECS UPLC C₁₈色谱柱、混合型弱阳离子交换SPE以及m/z较高的b或y MS碎片离子的联合使用提供了理想的选择性和灵敏度水平，从而实现了准确定量并从200 μL血浆中区分缓激肽浓度细微差异。标准曲线在5-10000 pg/mL的范围内准确精密。在高于基底浓度的情况下可精确定量的缓激肽最低浓度为5 pg/mL。所有浓度的QC样品均符合FDA法规标准^4,5，平均准确度范围为99.8-106.8，平均CV%为0.5-5.5。以上数据证实了这是一种准确且可重现的方法。本研究还证实了采用合适的蛋白酶抑制剂样品收集方式对于准确测定缓激肽内源性浓度的重要性。此外，如果需要执行进一步验证，本方法在通过LC-MS/MS对PK和临床研究的患者样品进行高灵敏度的缓激肽定量方面也表现出巨大的潜力。

参考文献
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