如何选择合适的定量PCR仪？（二）
2.创新概念的离心式实时定量pcr仪
为了克服平板式定量pcr温度均一性差的缺点，聪明的研究人员又开发出创新概念的离心式实时定量pcr仪，以roche罗氏的lightcycle和corbett的rotor-gene为代表。pcr扩增样品槽被巧妙地设计为离心转子的模样，借助空气加热和转子在腔内旋转，转子上每个孔都是“等位”的，几乎无差别，很好的解决了每个样品孔之间的温度均一性的关键问题——corbett的rotor-gene样品间温度差异小于±0.01℃，最大程度地保障了标准曲线和样品之间条件的一致性。利用空气做加热介质的优点在于能实现与反应体系无缝接触，接触面积大且加热均匀。虽然有竞争对手批评空气介质比热小，但事实上roche的lightcycle%202.0却是目前升温速度最快的定量pcr仪，可以达到20℃/秒！Corbett的Rotor-gene也可以达到5℃/秒(样品实际升温速度达到2.5℃/秒)，优于多数的平板式PCR仪。借助旋转离心力还可以随时将可能凝在管壁和盖子上的液滴离心到管底而无需热盖；还可以将酶加在管盖上，升温后离心到管底与反应体系混合，实现“机械的热启动功能”。由于升温速度快，对于常规需要2个多小时完成的定量PCR反应，Roche的LightCycler仅需20—30分钟即可完成，可以大大节约时间和提高工作效率。这一点对于研究人员来说极为有用，因为你不再需要等2个多小时才能看实验结果了，或者换句话来说，2个多小时你可以做4—5轮定量实验了。
由于转子上的样品孔是旋转可移动的，因而离心式荧光检测系统可以固定激发光源和荧光检测器，随时检测旋转到跟前的样品管——由于每个样品管在检测时距离检测器和激发光源的距离都是“等价”一样的，使用的是同一个检测器和激发光源，有效减少不必要的系统误差。固定的结构使得仪器运行更稳定，使用寿命更长；离心式定量PCR都是逐个检测样品的，所以大多采用了长寿的LED（发光二极管）冷光源，运行前无须预热，无须校正；系统检测重复性也更好。
离心式定量PCR仪的缺点主要是离心的转子小，能容纳的样本量有限，由于是离心式转子，常规的96孔板和条形管就不适用，有的还需要特殊的消耗品，增加使用成本。当然离心式定量PCR仪不可能带梯度功能。
Roche的Lightcycler刚推出的时候确实让人眼前一亮！现在Lightcycler2.0拥有令人心动的优点-----
快速：利用空气动力学原理，20－30分钟内完成30－40个循环。
控温准确：变温速率最高可达20℃/秒，温差≤±0.3°C
多波长检测：可同时在530、640及710nm三个通道进行检测，实现同管检测两个项目或设立检测项目的外对照和内对照。
此外动态检测范围达10个数量级，而无须将样品稀释；具有熔点曲线分析功能
可以鉴别基因型、检测点突变、检测非特异性扩增，具多种检测模式如Taqman探针、荧光染料SYBR Green
I检测、序列特异杂交探针等；探针及引物设计方便，杂交探针及引物设计的限制少，而且亦可方便地选用合适大小的扩增子（100-1000bp）。但是Lightcycler需要使用特定的毛细管作为样品管，这在某种程度上提高了消耗成本，也不方便作为常规PCR仪使用。
Corbett的Rotor-Gene也是离心式的定量PCR仪。在品牌的角度上Corbett当然不如Roche罗氏在国内那样家喻户晓，之所以特别提到这个产品，确实是因为Corbett的设计有独到之处。比如Corbett的Rotot-Gene3000标准型是真正独立的4通道(可建立新通道)，4个独立LED激发光源(470nm/
530nm/585nm/625nm)保证最少的光谱交叉 (<1 %)。PMT检测，6个检测滤光片，可检测荧光包括FAM/SYBR
Green I, TET，VIC/JOE，HEX，Max， NED/ TAMRA/ Cy3, ROX/Texas
Red,和Cy5，Cy5.5等等，机器的适用性非常宽，开放的试剂系统使得机器可适用Taqman探针、荧光染料SYBR Green
I检测、分子信标、FRET探针、Amplifluor探针等等，不像某些牌子的定量PCR仪只能适用Taqman法和荧光染料检测。Rotot-Gene3000灵敏度高，宽达12个数量级的线性范围，可正确区分1、2、3拷贝的基因，重复性极佳(R>0.99935)。由于转子在反应过程之中一直以恒定的低速旋转，使得样品间的温度均一性极佳(±0.01℃/秒)，同一热反应室提供完全相同的反应条件，同一光学通路提供完全相同的测量通道，每标本每循环检测32次，满足高精度和一致性要求。Rotot-Gene3000提供了36
x0.2ml和72x0.1ml两种转子，检测是通过薄壁管侧壁而非管底进行的，因而可以使用普通的0.2ml
PCR管，并允许在试管盖上标记，这降低了使用成本。Rotot-Gene3000的温控速度不如LightCycler，但优于多数的固定加热模块的机型，能达到5℃/秒(管内实际升温速度达到2.5℃/秒)。Corbett还有一个光学变性ZL——让待扩增样品预先进行一次熔解曲线程序，检测荧光染料信号大小的变化，找到代表全部双链DNA解链的峰值对应温度，在其后的反应中就无需总是将变性温度设为94度，也不需要延长孵育时间。这个ZL使得反应过程大大缩短。Rotot-Gene主要的问题也是可容纳的样品数量少，只能靠反应速度快，同样的时间可以多运行几轮反应来弥补。对于大量样品的实验室，Corbett同时还提供定量PCR反应自动加样系统，不单可以和自家的Rotor-Gene配套使用提高工作效率和均一性、安全性，也可以配套Roche和ABI的定量PCR仪。这样就不用担心加样累坏了。
3.第三类的荧光定量pcr仪以cepher公司的smart
cyclerii为代表，对于国内的用户来说比较新鲜，但这个一直受美国国防部和安全局、美国军队传染病医学研究中心、美国军队士兵和生物化学合作所资助的公司却相当有来头。smart%20cyclerii获得过1998年美国研发r&d100金奖。Smart
cyclerii的机型小巧，只有16个样品槽，它的独到之处在于这16个样品槽分别拥有独立的智能升降温模块，也就是说这16个样品槽相当于16台独立的定量pcr仪！独立控温的好处首先是，你可以在同一定量pcr仪上分别进行不同条件的定量pcr反应，更为灵活自定义的梯度优化反应也好，或者是完全不同的几组反应——甚至，你可能只进行个别样品的检测，只占用其中几个样品槽——过一会儿其它的同事也要用——他不需要等待你的反应结束，而可以随时利用空置的样品槽开始其它定量反应！对于各有各忙的多成员的实验室，要是个别样品就占据96孔样品槽，其它人每轮要再等2个多小时，有时还要等几轮，那可够郁闷的。smart
cyclerii的使用频率可以被最大化，大家都不用等待！这个世界上唯一允许不同条件pcr同时进行的定量pcr仪拥有独一无二的优点，是其它任何平板式或者离心式定量pcr都不具备的。
此外，每个温控模块只控制一个样品槽，升降温速度当然更快——高达10℃/秒，控温精度自然就更高——这里根本不用考虑不同样品槽之间的温度均一性的问题，只有每个模块控温精确度的问题。对于普通的96孔板固定加热模块，本身有控温精度和准确度的差异，再加上样品槽不同位置之间的温度差异，而Smart
CyclerII就完全减少了一个误差因素。优异的特性使得只要20分钟就可以完成常规的定量PCR反应，大大提高研究人员的工作效率。每个模块独立控制的激发光源和检测器直接与反应管壁接触，保证荧光激发和检测不受外界干扰，固定的结构使得仪器运行更稳定，使用寿命更长。整合有4通道光学检测系统，分别可以检测FAM/SYBR
Green I, Tet/ Cy3, Texas
Red和Cy5，可在同一样本中进行多靶点分析，同时检测4种荧光信号，可使用多种检测方法，包括Taqman探针、分子信标、Amplifluor引物和Scorpion引物和荧光内插染料等等。宽达9个数量级的线性范围。
不过Smart
CyclerII需要使用独家的扁平反应管，增加了反应成本，上样也不如传统的方法方便，而且16个样品槽也不大适合批量反应的要求——不过Smart
Cycler II的软件设计允许一台电脑同时操作6台Smart Cycler II，部分弥补了缺憾。所以Smart Cycler
II会更适合多成员、样本量不大、要求快速出结果的实验室。不是每个实验室都总是要同时检测几十上百个样品吧？
在选购定量PCR前之前我们需要先了解自己的需要——是同时检测大量样本？还是小规模的研究？是固定的标准化检测方法还是有机会尝试不同的方法？随着技术的加速发展不断有新的荧光素、标记方法和试剂盒面市，还要考虑仪器性能在将来的可拓展性等等。撰写本文的目的并非指出哪一类的仪器更适合我们的需要——毕竟不同应用领域、不同的实验室有着不同的需求，所以了解不同类型的定量PCR仪的特点有助于选择更适合自己需要的仪器，“不求最好，但求适合”。
