核酸检测实验室如何评价荧光定量PCR仪!
荧光定量PCR的检测是一系列从采样、保存运输、样品处理、核酸提取、扩增等一系列流程的组合，任何一个环节出现问题都会导致最终结果的错误。虽然在前面一系列的文章中讲述了提取试剂、扩增试剂的评价但是这些仍远远不够，因此我在后续的文章中会尽可能覆盖到所有的检测环节。
荧光定量PCR的检测离不开荧光定量PCR试剂和荧光定量PCR仪器。试剂的评价前面已经讲了（诊断试剂评价系列2-核酸检测方法（更正））。但是每次提到荧光定量PCR仪的评价，大家总是望而却步。一方面原因是荧光定量PCR仪涉及很多温度、光电信号需要专业的设备来评估，另一方面也确实不知道从哪里入手。今天我们梳理下在核酸检测实验室中如何通过试验来评价荧光定量PCR仪。
一、荧光定量PCR仪的物理性能试验相关指标
通过物理方法测定PCR性能的试验。主要包括测定温度和荧光来进行评价，由于需要专业的设备，建议联系计量部门或仪器厂家进行相关指标的测定。
最大升温速率：
50℃-90℃应不小于2.5℃/秒。
平均升温速率：
50℃-90℃应不小于1.5℃/秒。
最大降温速率：
90℃-50℃应不小于2.0℃/秒。
平均降温速率：
90℃-50℃应不小于1.5℃/秒。
模块控温精度：
应不大于0.5℃。
温度准确度：
测定值与设定值应不超过±0.5℃。
模块温度均匀性：
温度差值在±1℃范围内。
温度持续时间准确度：
温度持续时间与设定温度时间偏差在±5%以内。
热盖温度偏差：
温度差值在±3℃范围内。
荧光强度检测重复性：
高中低浓度校准染料重复测定的变异系数不大于3%。
荧光强度检测精密度
随机选取10个及以上个检测孔，用高中低浓度校准染料进行检测，变异系数不大于5%。
不同通道荧光干扰
其他通道荧光检测强度不高于目标通道荧光阈值。
二、荧光定量PCR仪的生物化学试验相关指标
对温度敏感的PCR反应对PCR仪进行生化性能试验。该指标可以通过荧光定量PCR的试验对仪器进行评价，每个核酸检测实验室都可以开展的评价试验。
样本检测重复性
对高中低浓度核酸样品进行检测，Ct值变异系数不大于3%。
样本线性
对系列稀释梯度浓度的样品（至少5个梯度）进行检测，回归系数R不低于0.99。
荧光线性
对系列稀释荧光染料（至少5个梯度）进行检测，回归系数R不低于0.99。
三、荧光定量PCR仪评价的试验设计
1.试验准备
1.1有证标准物质
国内外有证标准物质，标准物质类型为质粒DNA或RNA。不推荐使用自制没有进行定量的质控品。
1.2荧光染料
可以选用试剂盒自带的ROX染料或购买标准荧光染料。
1.3.荧光定量PCR方法
需要使用经过验证过的荧光定量方法：扩增效率90%-110%（越接近100%越好）；R2大于0.99；最低检测限应低于10 copies/反应。
1.4.反应体系
质量高口碑好的反应体系。
1.5.耗材
仪器推荐使用的专用于荧光定量PCR的耗材。
1.6.荧光定量PCR反应条件
常规荧光定量PCR反应条件，普通模式，40个循环。不建议使用快速模式和预扩增反应条件。
2.重复性试验
选择高中低浓度标准物质进行检测（推荐浓度为5000 copies/反应、500 copies/反应和50 copies/反应），每个浓度至少5次重复，样品管随机放置在反应板中心和边缘的不同位置 。Ct值变异系数不大于3%。
3.样本线性试验
对已知浓度的样品进行5倍或10倍梯度稀释（至少5个梯度），每一浓度梯度平行测试3孔，Ct均值的回归系数R不低于0.99。
4.荧光线性试验
对已知浓度的标准荧光染料进行梯度稀释（至少5个梯度），每一浓度梯度平行测试3孔，回归系数R不低于0.99。
5.不同荧光通道干扰试验
如果检测中使用双重或多重荧光检测，可设计如用FAM探针扩增用VIC通道检测，检测结果不应该有高于阈值线的荧光信号。
总结：荧光定量PCR仪的评价需要结合物理性能（温度和荧光）和生化性能（荧光定量PCR反应）才能获得仪器总体的表现。但是核酸检测实验室日常使用已知浓度的有证标准物质定期对荧光定量PCR仪进行评价也至关重要。唯有如此才能让我们的实验室各个环节都处在有效的质量控制下。
