乙肝患者外膜蛋白血清学检测及对于判定HBV DNA复制的...

乙肝患者外膜蛋白血清学检测及对于判定HBV DNA复制的意义

目的  探讨HBV感染者血清中PreS1-Ag、PreS2-Ag、大蛋白（LP）的检测意义及其对判定HBV复制的意义。

方法 应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测201例HBV感染血清的PreS1-Ag、PreS2-Ag、HBV-LP及HBV M，同时应用荧光定量PCR方法检测HBV DNA。

结果 PreS1-Ag、PreS2-Ag、LP、HBsAg阳性率差异有统计学意义，PreS2-Ag、LP检出阳性率均高于HBeAg；LP的检出阳性率与HBV DNA的检出阳性率相关性有统计学意义，且HBV DNA拷贝数的对数值与HBV-LP表达呈正相关。

结论 PreS1-Ag、PreS2-Ag、LP较准确的反映乙肝病毒的复制情况，是HBV M有益的必要补充；血清中HBV-LP的含量与HBV DNA的拷贝数具有较好的相关性。

【主题词】肝炎，乙型；肝炎病毒，乙型；肝炎抗原，乙型；病毒包膜蛋白；遗传标记

Significance  of hepatitis B virus PreS1-Ag, PreS2-Ag, large protein, PreS2-Ab  detection and the prediction of HBV DNA replication MAO Yuan-li , LI Bo-an , MA Hong-bin , SUN Zhi-qiang , SHI Jia-bin , LI Xiao- han, XU Jun, WANG Xue-fei, YANG Li-hua（ Center of Clinical Laboratory, The No. 302 Hospital of The People＇s Liberation Army, Beijing 100039, China ）

[Abstract:]  Objective To explore the significance of hepatitis B virus PreS1-Ag, PreS2-Ag, large protein （LP） detection and the prediction of viral replication. Methods PreSl-Ag, PreS2-Ag, LP, and HBV markers were measured by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） in 201 cases of infected serum. Serum HBV DNA level was quantitatively detected by real-time polymerase chain reaction （PCR）. Results  There were significant differences in positive rate between the  PreS1-Ag, PreS2-Ag, LP, and HBsAg; the positive rate of PreS2-Ag and LP  were higher than that of the HBeAg. No significant differences were  found in the positive rates between LP and the levels of HBV DNA and  there was a positive correlation between quantitations of HBV DNA and  HBV-LP. Conclusion Serum PreS1-Ag, PreS2-Ag and LP were laboratory  markers that can accurately reflect HBV DNA reproduction, and were  helpful complementarity to traditional HBV M. There is a close  correlation between the number of copies of HBV DNA and the levels of  HBV-LP

[Key words]  Hepatitis B; Hepatitis B virus ;Hepatitis B,antigens;Viral envelope proteins;Genetic marks 

乙型肝炎是影响人类健康的主要传染病之一，其不仅感染率高，而且易于慢性化，引起肝硬化和原发性肝癌。HBV为嗜肝DNA病毒，含有3200个核苷酸，含有4个开放读码框架，编码6种蛋白，其中S基因编码3种外膜蛋白，包括主蛋白（即HBsAg），中蛋白（即HBsAg和Pre-S2蛋白）和大蛋白（即HBsAg、Pre-S1蛋白和Pre-S2蛋白）^[1]。近年来随着对HBV外膜蛋白在乙型肝炎发病机制、感染与病毒复制等方面研究的深入，研究者们逐渐认识到了其具有越来越重要的临床意义，如Pre-S1抗原能够反映HBV的复制情况，可以作为预测干扰素治疗是否有效的指标，推测急、慢性乙型肝炎的预后情况，并可用于制备重组乙肝疫苗等^[2]。目前临床上习惯以HBeAg来判断乙肝病毒复制及传染性强弱。但是当乙肝病毒发生前C与C区变异后，会出现HBeAg阴性，而病毒仍复制的情况，造成临床难以确定停药时机及治疗结束后应答持续时间短等情况的出现^[3]。为探讨乙肝患者血清中HBV PreS1-Ag、PreS2-Ag、PreS1-Ab及LP检测的临床指导意义及其与HBV DNA水平的关系，本研究对201例慢性乙型病毒性肝炎患者的HBV DNA、HBV M、PreS1-Ag、PreS2-Ag、PreS2-Ab及LP进行了检测分析。

1 材料和方法

1.1 材料  随机选取解放军第三○二医院2002年6月至2006年3月乙肝患者血清201份，标本均于-80℃保存。HBV Pre-S1抗原检测、HBV Pre-S2抗原检测、HBV DNA实时荧光聚合酶链反应（PCR）定量检测及HBV M检测试剂盒分别购自上海阿尔法生物技术有限公司、北京肝炎试剂研制中心、达安基因公司和北京科卫试剂公司，检测HBV-LP的单克隆抗体由热景生物技术有限公司馈赠。

1.2 方法

1.2.1   HBV Pre-S1 Ag、Pre-S2 Ag、HBV DNA、HBV M及HBV-LP的检测：均严格按试剂盒操作说明进行。

1.2.2   统计学方法：采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。各种检测指标阳性率的比较均采用X²检验，HBV-LP含量与HBV DNA的拷贝数的相关性分析采用频数表的相关与回归分析。

2 结果

2.1  PreS1-Ag、PreS2-Ag、LP、HBsAg阳性率比较

血清检验结果见表1。统计分析表明4种外膜蛋白检出阳性率差异有统计学意义（X²=72.57，P=0.00＜0.01），进一步统计分析表明PreS1-Ag、PreS2-Ag检测的阳性率差异无统计学意义（X²=3.81，P=0.05＞0.01），同时LP与HBsAg检出阳性率差异也无统计学意义（X²=4.89，P=0.03＞0.01）。

表1  血清PreS1-Ag、PreS2-Ag、LP、HBsAg、HBeAg检测结果

Tab .1 Detection of serum PreS1-Ag,PreS2-Ag,LP and HBsAg

2.2  PreS1-Ag、PreS2-Ag、LP、HBsAg阳性率比较

统计分析表明PreS1-Ag、PreS2-Ag、LP、HBsAg检出阳性率差异有统计学意义（X²=53.80，P=0.00＜0.01），进一步统计分析表明PreS1-Ag与HBeAg检测的阳性率差异无统计学意义（X²=2.36，P=0.12＞0.01），但PreS2-Ag、LP检出阳性率均高于HBeAg（X²=12.18，P=0.00＜0.01；X²=50.58，P=0.00＜0.01）。

2.3  PreS1-Ag、PreS2-Ag、LP与HBV DNA阳性率的比较

检测结果见表2。统计分析表明PreS1-Ag、PreS2-Ag与HBV DNA检测阳性率差异有统计学意义（X²=51.57，P=0.00＜0.01；X²=32.36，P=0.00＜0.01），但LP与HBV DNA检测阳性率差异无统计学意义（X²=3.86，P=0.05＞0.01）。

 表2 前S1、前S2、大蛋白阳性率与HBV DNA阳性率的比较

Tab. 2  The relationship between PreS1-Ag,PreS2-Ag,LP and HBV DNA 

2.4 HBV-LP与HBV DNA的相关性 

HBV DNA拷贝数的对数值与HBV-LP定量值的相关系数r=0.902，回归方程为Y=1.604+0.501X（P＜0.05），这一结果说明HBV DNA拷贝数的对数值与HBV-LP定量值具有正相关关系，HBV DNA拷贝数的对数值变化可以用HBV-LP定量值为解释变量的线性回归模型来推导。 

3  讨论

乙肝病毒感染人体后，在血清中存在形式主要有三种，即大球形颗粒（Dane颗粒）、小球形颗粒和管形颗粒。前S1抗原、前S2抗原只在Dane颗粒上表达，前S1抗原由108~110个氨基酸残基组成，其21~47位氨基酸为肝细胞膜受体。前S2抗原含有55个氨基酸残基，其C端与表面抗原N端相连，其N端109~133位氨基酸为聚合人血清蛋白受体^[4]。因此，二者可作为乙肝病毒感染复制的指标。但通过研究鸭乙肝病毒发现，含有嗜肝病毒血清的感染性不仅依赖于具有感染性Dane氏颗粒的多少，而且还依赖于缺乏核酸的亚病毒颗粒（SVPs，subviral particles，包括管状颗粒和小球颗粒）的数量，该亚病毒颗粒在HBV感染过程中，能显著增强细胞内的病毒复制和基因表达，而这种增强作用是由pre-S蛋白的反式激活作用所触发的^[5]。还有研究发现，在HBV形成包膜的过程中需要大蛋白（即HBsAg、Pre-S1蛋白和Pre-S2蛋白）和中蛋白（即HBsAg和Pre-S2蛋白）的参与^[6,7]，因此除了检测HBsAg外，Pre-S蛋白的存在对于临床判定HBV复制具有一定意义。

本研究对目前较常用的HBV外膜前蛋白检测指标（包括Pre-S1、Pre-S2及大蛋白）进行了相关性研究，同时比较了它们与HBV M的关系及其在判定HBV DNA复制中意义。结果显示，在外膜蛋白中HBsAg与LP的阳性率高于Pre-S1蛋白和Pre-S2蛋白，同时Pre-S1蛋白和Pre-S2蛋白阳性率差异无统计学意义。这一结果表明单独的PreS1或PreS2蛋白的检测仅能部分反应HBV外膜蛋白在血清中的表达状态。其原因可能与试剂盒包被单抗针对抗原表位有关，Pre-S1、Pre-S2蛋白检测试剂盒仅仅针对线性表位，但是编码Pre-S蛋白的LP Pre-S区具有较为复杂的拓扑结构^[6]，便可能是导致Pre-S1及Pre-S2抗原的检出率低于LP的原因。进一步研究表明PreS1-Ag与HBeAg检测的阳性率差异无统计学意义，而PreS2-Ag、LP检出阳性率均高于HBeAg，提示外膜蛋白是对HBeAg检测的有益的补充，尤其对选择压力导致HBV前C/C变异后HBeAg终止表达的患者更有意义。

虽然目前医学界认为外周血HBV DNA是HBV复制最直接和可靠的指标，可以用来判定患者和携带者有无传染性，但如前所述HBV DNA的检测无法反应SVPs的存在与载量。我们研究也证明了这一推断，在DNA阴性的患者中存在着Pre-S1、Pre-S2抗原及LP阳性的病例。但统计分析发现Pre-S1、Pre-S2抗原检出的阳性率低于HBV DNA，这可能与ELISA方法检测的灵敏度有关。进一步的分析表明LP与HBV DNA的阳性率差异无统计学意义，同时经回归检验证明HBV DNA拷贝数的对数值与HBV-LP定量值具有正相关关系，由此可见，HBV-LP在反应病毒复制方面是一个较好的指标，可以部分作为HBV DNA的替代及补充检测指标。并且Pre-S1、Pre-S2及LP阳性可能是肝内病毒继续复制和抗病毒治疗不彻底的标志，但是对于这一结论还需要进一步研究。 

 参考文献

[1]  Barrera  A,Guerra B,Notvall L,et al.Mapping of the hepatitis B virus pre-S1  domain involved in receptor recognition.J Virol,2005,79:9786-9798.

[2]  Stoeckl  L,Funk A,Kopitzki A,et al.Identification of a structural motif crucial  for infectivity of hepatitis B viruses.Proc Natl Acad Sci U S  A,2006,103:6730-6734.

[3]  Caeta  GB,Stornaiuolo G,Precone DF,et al.Epidemiological and clinical burden  of chronic hepatitis B virus/hepatitis C virus infection multicenter  Italian study.J Hepatol,2003,39:1036-1041.

[4]  王鸿利.实验诊断学[M].北京:人民卫生出版社,2001.9-9.

[5]  Bruns  M,Miska S,Chassot S,et al.Enhancement of hepatitis B virus infection by  noninfectious subviral particles.J Virol,1998,76:1462-1468.

[6]  Lambert  C,Mann S,Prange R.Assessment of determinants affecting the dual  topology of hepadnaviral large envelope proteins.J Gen Virol,2004,85(Pt  5):1221-1225.

[7]  Bruss V.Envelopment of the hepatitis B virus nucleocapsid.Virus Res,2004,106:199-209.