酶免疫分析技术测定农残的原理和发展

20世纪70年代,由于酶免疫分析技术和单克隆抗体(McAb)制备技术的出现,免疫学技术取得了快速的发展。

 混配农药的生产和使用剧增,给抗体的制备和农药免疫分析提出了新的问题。农药多组分免疫分析的方法有两种:一种是先制备单一农药的单克隆抗体,然后把这些抗体混合在一起对样品进行检测,这种方法的缺点是制备抗体费时,而且抗体消耗量大;另一种方法是用能产生部分交叉反应的结构类似物,制成合适的免疫原,对动物进行免疫,以获得针对某类具有相同或类似结构的农药的特异性抗体,分析一类农药。这种方法在检测时间和成本上具有优势,成为农药免疫分析发展的一种趋势。

  近年来,国外已经有学者利用有机磷农药中的结构类似物制备多克隆抗体,用来分析有机磷类农药。如1998年Banks利用许多有机磷农药的共有结构硫代磷酸酯通过一个4碳链与蛋白质联结作免疫原,制备多克隆抗体。竞争性ELISA法检测同类有机磷农药对多克隆抗体的抑制率,结果显示,杀螟硫磷、丁烯硫磷、巴胺磷和敌敌畏对上述多克隆抗体具有高抑制率,当抑制率为50%时,这四种农药的浓度分别是4.8μg/mL,8.2μgmL,36.2g/mL和91.1ug/mL。2000年 Alcocer等人将4-膦酰基-2-丁烯酸(trans-4-phosphono-2-butenic acid,TPB)作抗原制备抗体,应用间接 ELISA检测抗体的交叉反应。产生交叉反应的29种农药中,毒虫畏、乙基对氧磷和杀线磷三种农药的I50分别是24ng/mL,37ng/mL和100ng/mL,低于TPB对抗体的I(225ng/mL)。这三种农药的最低检测限也低于TPB抗体已由多克隆抗体、单克隆抗体发展到重组抗体(Rec abs),之所以形成这样一个发展趋势是因为杂交瘤细胞并不能对一个给定多抗的特性进行人工操纵,而这种对一个给定多抗进行人工操纵的特性正是重组抗体的功能。重组抗体技术是指利用基因工程中的重组技术对一大群B细胞的重链V区(可变区)基因与同等大量轻链V区基因随机融合以创造所有的组合,从而包含大量的结合位点(Fv区)。将这些结合位点克隆到噬菌体内,对它们的特异性进行选择。

  重组抗体技术产生的抗体不需经过任何一轮筛选即可得到,其成功率取决于功能轻链基因家族通过特殊引物扩增的效率,获得抗体的速度快且相对容易。当然,重组抗体技术产生抗体的同时也会产生一些假基因。与单抗和多抗相比,重组抗体还有许多优点,如产生新功能以及改变亲和性和特异性等。Marcos.J.C.Alcocer(2000)等人将重组抗体技术用于农药分析,他们成功地从两种鼠类杂交瘤细胞系中获得两个有功能的针对有机磷农药毒死蜱的scFv(single-chain Fv)抗体。

  我国学者20世纪90年代才开始农药免疫分析的研究,主要是ELISA法。1992年,农业部天津环保所刘长武等人首先报道制备了对硫磷的抗体。随后国内学者相继进行了阿维菌素、莠去津、氯黄隆、杀虫脒、甲胺磷、克百威等农药的免疫分析。所获抗体有些具有较高的检测水平,而且具有特异性,例如莠去津的最小检测浓度达1ng/mL,西玛津可达0.5ng/mL,克百威≤0.01ng/Ml。目前我国学者在这一领域还处于摸索阶段,在小分子农药与载体蛋白的联结、抗体的制备、ELISA检测条件摸索和试剂盒研制等方面与国外还有很大的差距。

  与国外不同,我国的农药使用有自己的特点。虽然国家有关部门规定禁止在某些作物上使用高毒高残留的农药,但是,在农村这些农药的使用量仍然较大,特别是有机磷类农药。因此,建议我国学者多开展针对这些高毒高残留农药的酶联免疫分析技术,以保障我国人们身心健康和促进农业的可持续发展。