分光光度计的基本原理是建立在光与物质相互作用的基础上,当光子和某一溶液中吸收辐射的物质分子相碰撞时,就发生吸收,测量其吸光度值的大小可反映某种物质存在的量的多少。光的吸收程度与浓度有一定的比例关系,这就是著名的比直定律。该定律成立的必要条件是单色光(单一波长光)照射样品。
为了使该定律具有良好的线性,对测量浓度有一定的范围要求。也就是吸光度值控制在0.2～0.7之间,并且要求单色光垂直照射样品,试样要均匀。一台性能优良的分光光度计,必须有一个高性能的光路系统即单色仪。单色仪有两类:一类是以玻璃三棱镜为色散元件组成;另一类是由光栅为色散元件组成。两种单色仪各有利弊,用石英玻璃做成的单色仪,在紫外光区有较高的色散率,波长精度较高,分辨率可达0.2nm,但在可见光区要大于2nm,波长精度不线性,像751G型分光光度计,是由光栅做成的单色仪,在全段波长(200nm～800nm)之间具有相同的波长精度。但目前大部分光栅或分光光度计所用的光栅都是复制光栅,波长精度不太高,如754、722、752型分光光度计,波长精度在±2nm。
紫外分光光度计的工作波长在200～1000nm之间，其波长范围涵盖紫外光（200～400nm）、可见光（400～750nm）及近红外光（750～1000nm）。在紫外光区（200～350nm）测定时必须用石英杯。