细胞调亡的流式细胞仪检测技术

2018年7月13日 13:47:06 来源: 互联网
收藏到BLOG

一、固定细胞的染色方法

1PI单染色法

方法一

1.收集细胞(15)×106个,5001000r/min离心5min,弃去培养液。

2.3ml PBS洗一次。

3.离心去PBS,加入冰预冷的70%的乙醇固定,4℃,1h

4.离心弃去固定液,3ml PBS重悬5min

5.400目的筛网过滤1次,5001000r/min离心5min,弃去PBS

6.1ml PI染液,4℃避光30min

7.流式细胞仪检测:PI用氩离子激发荧光,激发光波波长为488nm,发射光波波长大于630nm,产生红色荧光,可分析前散射光对侧散射光的散点图及PI荧光的直方图。

 

方法二

1.收集细胞(1×106个),5001000r/min离心5min,弃去培养液。

2.1ml PBS/FCS洗一次。

3.5001000r/min离心5minPBS/FCS,加入500μl PBS/FCS500μl的多聚甲醛固定液,轻轻混匀,在4℃下固定4min

4.5001000r/min离心5min弃去固定液,室温加入含0.2 TweenPBS 1ml37℃孵育15min

5.1ml PBS/FCS3次,每次5min

6.400目的筛网过滤1次。

7.5001000r/min离心5minPBS/FCS,用1.0ml PI染液,4℃避光至少30min。染色在24h之内皆可行,流式细胞仪分析。

 

2)调亡细胞的TUNEL的流式细胞仪分析

1.离心收集细胞,PBS12次。

2.1%多聚甲醛低温下固定15min

3.3ml PBS1次,70%乙醇固定,冰箱内放置13天。

4.PBS轻洗1

5.细胞与TdT标记液37℃孵育,时间12h

6.PBS轻洗1次。

7.细胞在黑暗中37℃与100μl的染色缓冲液孵育30min

8.0.1 Triton-X 100PBS轻洗1次。

9.1ml PBS(含5mg/ml PI, 0.1% RNase A)重悬。

10.  流式细胞仪分析红色(PI)对绿色荧光(FITC)的地形图。

 

3ISNT的流式细胞仪分析

1.离心收集细胞,PBS12

2.1%多聚甲醛低温下固定15min

3.3ml PBS1次,70%乙醇固定,冰箱内放置13天。

4.PBS轻洗1次。

5.2×105细胞与12.5μl的缺口平移缓冲液在15℃共孵育6h,每过15min振动1次。

6.PBS轻洗1次。

7.细胞在黑暗中37℃与100μl的染色缓冲液孵育30min

8.0.1 Triton-X 100PBS轻洗1次。

9.1ml PBS(含5mg/ml PI, 0.1% RNase A)重悬。

10.  流式细胞仪分析红色(PI)对绿色荧光(FITC)的地形图。

 

二、非固定细胞的染色方法

1Hoechst 33342/PI双染色法

1.悬浮生长的细胞在培养状态下加入Heochst 33342,终浓度为1μg/ml;帖壁生长的细胞用含有0.02EDTA0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液,离心,弃上清,用1ml全培养液重悬细胞,加入Heochst 33342,终浓度为1μg/ml37℃孵育710min

2.4 5001000r/min离心弃去染液。

3.加入1.0ml PI染液,4℃避光染色15min

4.400目的筛网过滤1次。

5.流式细胞仪分析。

 

2Annexin V/PI双染色法

1.细胞收集:悬浮细胞直接收集10ml的离心管中,而帖壁细胞先用滴管轻轻吹打,调亡细胞一经吹打可能脱壁,收集到10ml的离心管中,没脱壁的细胞用0.02%的EDTA消化使之脱壁,每样本细胞数为(15)×1065001000r/min离心5min弃去培养液。

2.用孵育缓冲液洗1次,5001000r/min离心5min

3.100μl的标记溶液重悬细胞,室温下避光孵育1015min

4.5001000r/min离心5min沉淀细胞,孵育缓冲液洗1次。

5.加入荧光溶液4℃下孵育20min,避光并不时振动。


本文来源: 互联网
qrcode //m.antpedia.com/news/2224709.html
扫描二维码,在手机上查看:
细胞调亡的流式细胞仪检测技术
http://m.antpedia.com/news/2224709.html

我来说两句

验证: seccode