几种常见的微生物基础实验（二）
实验三 菌种保藏
一、实验目的
1、学习并掌握菌种保藏的基本原理.
2、掌握常用的几种不同的菌种保藏方法.
二、实验原理
微生物个体微小、代谢旺盛、生长繁殖快,如果保存不妥容易发生变异和杂菌污染,甚至导致细胞死亡等现象.因此,保存好菌种是非常必要和重要的.常用的菌种保藏方法包括传代培养法、载体法、悬液法、冷冻法和真空干燥法
三、试剂与器材
1、材料 大肠杆菌、青霉菌、放线菌
2、试剂 液体石蜡、甘油、五氧化二磷、95％乙醇、10％盐酸、无水氯化钙、食盐、干冰
3、器材 无菌吸管、无菌滴管、无菌培养皿;安额管、冻干管、40目与100目筛子、油纸、滤纸条(0.5X1、2cm)、干燥器、真泵器、真空泵、真空压力表、喷灯、L形五通管、冰箱、低温冰箱(—30℃)、超低温冰箱和液氮罐等.
四、实验内容
1、斜面保藏法
2、液体石蜡法
3、穿刺保藏法
4、砂土管保藏法
5、冷冻真空干燥保存法
五、关键步骤及注意事项
1、清楚各种保藏方法的优缺点,针对不同要求选择适宜的保藏方法.
2、熔封安瓶时防止封闭不严.
3、液氮冻存操作应防止冻伤.
六、思考题
根据你自己的实验谈谈1--2种菌种保藏方法的利弊?
实验四 细菌形态观察及单染色
一、实验目的
1、了解简单染色法的原理,并掌握其操作方法.
2、学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术.
3、巩固显微镜(油镜)的使用方法.
4、初步认识细菌的形态特征.
二、实验原理
细菌个体微小,且较透明,必须借助染色法使菌体着色,与背景形成鲜明的对比,以便在显微镜下进行观察.根据实验目的不同,可分为简单染色法、鉴别染色法和特殊染色法等.简单染色法是最基本的染色方法,是利用单一染料对细菌进行染色.此法操作简便,适用于菌体一般形状和细菌排列的观察.常用碱性染料进行简单染色.
三、试剂与器材
1、材料 大肠杆菌,枯草芽孢杆菌
2、试剂 吕氏碱性美蓝染液(或草酸铵结晶紫染液)、齐氏石炭酸复红染液.
3、器材 显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶(内装香柏油和二甲苯)等.
四、实验内容
简单染色法:涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检
五、关键步骤及注意事项
1、涂片时,生理盐水及取菌不宜过多,涂片应尽可能均匀,
2、水洗步骤水流不宜过大,过急,以免涂片薄膜脱落.
六、思考题
1、你认为制备细菌染色标本时,尤其应该注意哪些环币?
2、为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察?
3、如果你的涂片未经热固定,将会出现什么问题?如果加热温度过高、实验五 放线菌及霉菌形态观察
一、实验目的
1、了解放线菌、霉菌形态观察的原理;
2、学习并掌握观察放线菌、霉菌形态的操作方法;
3、初步了解放线菌、霉菌的形态特征.
二、实验原理
放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌.常见放线菌大多能形成菌丝体,紧贴培养基表面或深入培养基内生长的叫基内菌丝(简称“基丝”),基丝生长到一定阶段还能向空气中生长出气生菌丝(简称“气丝”),并进一步分化产生孢子丝及孢子.有的放线菌只产生基丝而无气丝.在显微镜下直接观察时,气丝在上层、基丝在下层,气丝色暗,基丝较透明.孢子丝依种类的不同,有直、波曲、各种螺旋形或轮生.
霉菌可产生复合分枝的菌丝体,分基内菌丝和气生菌丝,气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝,由繁殖菌丝产生孢子.霉菌菌丝体(尤其是繁殖菌丝) 及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据.霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多,常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍,因此,用低倍显微镜即可观察.人们设计了各种培养和观察方法,这些方法的主要目的是为了尽可能保持放线菌自然生长状态下的形态特征.本实验采用插片法.
插片法:将放线菌接种在琼脂平板上,插上灭菌盖玻片后培养,使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻上.观察时,轻轻取出盖玻片,置于载玻片上直接镜检.这种方法可观察到放线菌自然生长状态下的特征,而且便于观察不同生长期的形态.
三、试剂与器材
1、材料 黑曲霉、青霉和根霉,细黄链霉菌或青色链霉菌,灭菌的高氏I号琼脂和灭菌的查氏培养基.
2、实验器材 经灭菌的:平皿、玻璃纸、无菌吸管、盖玻片、玻璃涂棒,以及载玻片、接种环、接种铲、镊子、显微镜等.
四、实验内容
倒平板→接种→插片→培养→镜检
五、关键步骤及注意事项
1、倒平板要厚一些,接种时划线要密.
2、插片时要有一定角度并与划线垂直.
3、观察时,宜用略暗光线;先用低倍镜找到适当视野,更换高倍镜观察.
4、如果用0、1%美蓝对培养后的盖玻片进行染色后观察,效果会更好.
六、思考题
1、镜检时,你如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝？
2、你认为霉菌和放线菌菌丝的主要区别是什么？
