共聚焦激光扫描显微镜的应用及荧光探针
一、LSCM常用的检测内容及其荧光探针
LSCM检测内容和应用范围非常广泛，以下仅简单介绍LSCM常用的检测内容及其荧光探针。
1．细胞内游离钙 共聚焦激光扫描显微镜常用的有Fluo-3、Rhod-1、Indo-1、Fura-2等，前两者为单波长激光探针，利用其单波长激发特点可直接测量细胞内Ca2+动态变化，为钙定性探针；后两者为双波长激发探针，利用其双波长激发特点和比率技术，能定量细胞内i，为钙定量探针。
定量细胞内[Ca2+]i也可用双波长激发探针Indo-1和Fura-2。由于这些探针须用比率技术，因此又称为钙比率探针。
钙比率探针在溶液中均有荧光，测量时须洗去细胞外液探针，而进入细胞后的探针其AM被分解后不能透出质膜。由于这些探针要用紫外激发光作激发光源，会造成细胞的损伤，还会增加潜在的自发荧光，而且荧光发射峰波长也较短，须提高发光强度，因而其使用受到一定的限制。
2． DNA和RNA?摇核酸的荧光探针 用于共聚焦激光扫描显微镜的主要有Acridine Orange(吖啶橙，AO)、Propidium Iodide(碘化丙啶，PI)。两种染料既可标记DNA又可标记RNA，如为获得单独的DNA或RNA分布，染色前可用RNA酶或DNA酶处理细胞。PI不能进入完整的细胞膜，故不能标记活细胞内的DNA和RNA。
3． 膜电位 以往测定膜电位多用微电极直接插入法测量，不仅操作麻烦，而且对细胞也是一种损伤。共聚焦激光扫描显微镜则可利用荧光探针在细胞膜内外分布的差异测出膜电位，不但可以观察细胞膜电位的变化结果，更重要的是可以用于连续监测膜电位的迅速变化。
膜电位荧光探针根据其对膜电位变化反应速度的快慢分为快、慢两类探针，各类均有10多种。DiBAC4(3)为最常用的膜电位荧光探针，DiBAC4(3)为带负电荷的阴离子慢反应染料。该探针本身无荧光，当进入细胞与胞浆内的蛋白质结合后才发出荧光，测量时要求细胞浸在荧光染料中。
当细胞内荧光强度增加即膜电位增加示细胞去极化；反之，细胞内荧光强度降低即膜电位降低示细胞超极化。Rhodamine 123主要用于线粒体膜电位测量。Rhodamine123是一种亲脂性阳离子荧光探针，当线粒体膜内侧负电荷增多时，荧光强度增加，与DiBAC4(3)的表示形式相反。
4． pH值 正常细胞胞浆内的pH一般在6.8～7.4的范围，而某些细胞器如溶酶体的pH则在4.5～6.0之间。根据检测对象pH的不同将荧光探针分为用于偏中性和酸性两类。常用于偏中性pH即细胞胞浆pH检测的荧光探针有SNARF类(SNARF-1、SNARF-calcein)、SNAFL类(SNAFL-1、SNAFL-calcein)、BCECF等，这些探针均为疏水性探针，须使用其AM形式。
FITC-dextran则适用于pH范围4～6之间，如溶酶体pH的检测，该探针也不能透过质膜，但可通过细胞胞饮作用进入溶酶体，因此应选择分子量稍小的Dextran(葡聚糖)。
5． 细胞内活性氧基 活性氧(active oxygen species)可影响细胞代谢，与蛋白质、核酸、脂类等发生反应，有些反应是有害的，因此测量活性氧在毒理学研究中有一定的意义。根据检测活性氧的不同可选择不同的荧光探针。
常用荧光探针有Dichlorodihydrofluorescein diacetate(2，7-二氯二氢荧光素乙酰乙酸、H2DCFDA)，其原理是不发荧光的H2DCFDA进入细胞后能被存在的过氧化物、过氧化氢等氧化分解为二氯荧光黄（dichlorofluorescein，DCF)而产生荧光，其反应灵敏到10～12 mole水平，荧光强度与活性氧的浓度呈线性关系。
6． 细胞间通讯 共聚焦激光扫描显微镜可采用荧光光漂白恢复(fluorescence recovery after photobleading，FRAP)技术检测细胞缝隙连接通讯，该方法的原理是一个细胞内的荧光分子被激光漂白或淬灭，失去发光能力。
而临近未被漂白细胞中的荧光分子可通过缝隙连接扩散到已被漂白的细胞中，荧光可以逐渐恢复。由于光漂白过程是不可逆的，因此可通过观察已发生荧光漂白细胞其荧光恢复过程的变化量来判断细胞缝隙连接的通讯功能。
采用FRAP技术检测细胞间通讯常用荧光探针是6-carboxyfluorescein diacetate(6-羧基荧光黄乙酰乙酸盐、CFDA)，需用其酯化形式CFDA-AM。该技术可用于研究胚胎发生、生殖发育、神经生物学、肿瘤发生等过程中缝隙连接通讯的基本机制和作用。
由于某些毒性物质尤其是促癌物可影响缝隙连接介导的物质运输，因此该方法也可用于鉴别对缝隙连接作用有潜在毒性的化学物质。
7． 细胞膜流动性 采用荧光光漂白恢复(FRAP)技术还可对细胞膜流动性进行研究。利用NBD-C6-HPC荧光探针标记细胞膜磷脂，然后用高强度的激光束照射活细胞膜表面的某一区域(1～2μm)，使该区域的荧光淬灭或漂白，再用较弱的激光束照射该区域。可检测到细胞膜上其他地方未被漂白的荧光探针流动到漂白区域时的荧光重新分布情况。荧光恢复的速率和程度可提供有关的信息。
8． 细胞亚微结构(细胞器探针)?摇 一般的光学显微镜由于分辨率有限，在观察细胞器结构时受到一定的限制，而共聚焦激光扫描显微镜可获得较一般普通光学显微镜分辨率高的细胞内线粒体、高尔基复合体、内质网、溶酶体等细胞器图像，同时还可动态观察活细胞状态下细胞器的形态学变化情况，此外还可通过光学切片即断层扫描技术进行三维重建，显示细胞器的空间关系及其变化。
适用于线粒体的荧光探针较多，如Mitotracker、DA SPMI、DA SPEI、JC-1、罗丹明 123等。高尔基复合体常用的荧光探针有NBD 酰基鞘氨醇（ceramide）、BODIPY 酰基鞘氨醇。内质网主要用Dil、DiOC6(3)。溶酶体的荧光探针有DAMP、neutral red。
9． 标记抗体、配体等常用的荧光探针 共聚焦激光扫描显微镜不仅可用免疫荧光分析固定的细胞或组织切片，还可用于分析活细胞，得到特异性抗体或其他荧光免疫探针识别靶分子的表达、定位、分布变化等信息。
标记抗体、配体或蛋白质等较通用的有异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)，在碱性条件下FITC的异硫氰酸基与免疫球蛋白的自由基经碳酰胺化而形成硫碳胺基键，成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。一个IgG分子上最多能标记15～20个FITC分子。
但FITC易产生光漂白现象，发射带较宽，故在用于双标记时会和其他染料的发射带重叠，且带负电荷，对pH值的变化较敏感，因而限制了其在活细胞检测中的应用。
10． 检测酶活性的荧光探针 共聚焦激光扫描显微镜除了具备荧光显微镜检测荧光酶细胞化学的作用以外，在检测活细胞酶活性动态变化方面有着无可比拟的优势。通过对细胞施予不同的处理因素可检测细胞内相应的酶被激活或灭活的动态变化过程。有的酶荧光探针是自身就可发出荧光、有的是与酶结合后发出荧光、有的则是被酶分解后发出荧光。
以往记录荧光信号的仪器主要有荧光显微镜、荧光分光光度仪、流式细胞仪等。与这些仪器相比，共聚焦激光扫描显微镜不仅可广泛用于荧光定性、定量测量，同时具备细胞断层扫描、三维图像重建、活细胞动态荧光监测、荧光光漂白恢复、激光显微外科等方面的功能。
此外，共聚焦激光扫描显微镜还可用于多重荧光染色的检测，如同时观察细胞膜、细胞器、细胞核结构，也可同时检测细胞内游离钙和pH或膜电位等的动态变化。总而言之，共聚焦激光扫描显微镜可进行多参数、多功能的研究，且快速准确、自动化程度高，是检测组织细胞荧光信号的最为新颖和先进的技术手段。
二、共聚焦荧光探针的选择
共聚焦激光扫描显微镜是20世纪80年代来发展起来的一种新型高精度显微镜系统，辅以各类荧光探针或荧光染料与被测物质特异性结合，不仅可观察固定的细胞、组织切片，还可对活细胞的结构、分子、离子进行实时动态地观察和检测。
荧光探针的发展非常迅速，目前仅美国Molecular Probes公司就可提供1800多种荧光探针，每年该公司还不断推出新的荧光探针。通常每项检测内容或被测物质都有几种或几十种有关的或特异的荧光探针。
1． 选择荧光探针的一般考虑 选择合适的荧光探针是有效地进行实验并获取理想实验结果的保障。荧光探针的选择主要从以下几个方面考虑。
（1）仪器所采用激光器的类型：应根据仪器采用激光器的类型进行探针选择。如共聚焦激光扫描显微镜(Bio-Rad 1024，美国Bio-Rad公司产品)采用氪/氩离子激光器，激发波长为488nm，568nm，647nm，可激发多种荧光探针。
（2）荧光探针的光稳定性和光漂白性：在进行荧光定量和动态荧光监测时，要求荧光探针有较高的光稳定性，也可通过减少激光扫描次数或降低激光强度的方法，来减轻光漂白的程度。但在进行膜流动性或细胞间通讯检测时则需要荧光探针既有一定的光稳定性又要有一定的光漂白性。
（3）荧光的定性或定量：仅做荧光定性或仅是观察荧光动态变化时，选择单波长激发探针，无须制作工作曲线。做定量测量时最好选用双波长激发比率探针，利于制定工作曲线。
（4）荧光探针的特异性和毒性：尽量选用毒性小、特异性高的探针。
（5）荧光探针适用的pH：大多数情况下细胞的pH在生理条件下，但当pH不在此范围时，考虑适用该环境pH的荧光探针是有必要的。同时应注意染液自身的pH值会影响带电荷的荧光探针与胞内组分之间的结合，因此在染液的配备时须加以考虑。
2. 使用荧光探针的注意事项 不同的荧光探针在不同标本的效果常有差异，除综合考虑以上因素以外，有条件者应进行染料的筛选，以找出最适的荧光探针。
此外，许多荧光探针是疏水性的，很难或不能进入细胞，须使用其乙酰羟甲基酯(acetoxymethyl，AM)形式，也就是荧光探针与AM结合后变成不带电荷的亲脂性化合物方易于通过质膜进入细胞，在细胞内荧光探针上的AM被非特异性酯酶水解，去掉AM后的荧光探针不仅可与细胞内的靶结构或靶分子结合且不易透出质膜，从而能有效地发挥作用。
