微白蛋白尿检测：临床生化所面临的挑战
本文导读:
描述了尿白蛋白的三种形式；
陈述了微白蛋白尿（MA）的三种定量测定；
探讨了两种用于糖尿病和非糖尿病人MA筛查的方法；
评价了HPLC检测MA的潜在优势。
在“正常”或健康人尿中可以检测出非常少量的白蛋白。微白蛋白尿（MA）一词的含义是指尿白蛋白排泄（UAE）范围高于“正常”水平但又达不到表示明显肾脏损害的蛋白尿水平。MA在一般人群中的发生率约为6%。在出现MA的人群中，63%患有高血压，38%患有慢性肾病，26%患有糖尿病。对患有或没有患糖尿病的人来说，MA是发生肾脏和心血管疾病（CVD）的一项重要危险因素。因此，对MA的检测应采用高度敏感和特异的方法使其能尽早被检出，以助于糖尿病性肾病和CVD的治疗。预防、延迟或减轻白蛋白尿的发生是保护肾脏和心血管的一个关键治疗目标。
目前就为什么白蛋白尿是一个独立的危险指标尚无一致意见，但是有几种可能的因素。一是白蛋白的漏出表明血管尤其是血管壁出现功能障碍；二是由漏出引起的血管炎症会进一步损害血管壁。不管发生机制如何，实验室需要更多地关注微白蛋白的检测。在有可能患肾病的危险人群中，目前只有21.1%的人做过检测；在有条件的区域，也只有50%的人做过筛查。本文意在阐明糖尿病性肾病和CVD患者中，作为危险因素的MA早期确定的需要性；同时也对常规和新的白蛋白检测方法进行了述评。
作为危险因素的微白蛋白糖尿病性肾病美国约有一千三百万人被诊断为糖尿病，这一数字到2010年会增加到一千四百五十万，2020年将会达到一千七百四十万。1、2型糖尿病是最常见的糖尿病类型，美国的糖尿病患者中5%到10%为1型，90%到95%为2型。肾病是糖尿病的一个主要并发症。发生在糖尿病性肾病患者体内的渐进性肾损害主要表现为UAE的增多，即初期主要为持续性的MA、随后为持续性的蛋白尿。不管UAE是否仅为高于正常但尚未达到肾功能病理损害水平，只要出现MA就表明肾脏的损害正在发生，因而MA被认为是代表着“初始”肾病的发生。而另一方面，蛋白尿则表明已出现“明显”的肾病或肾衰竭，并在终末期肾病（ESRD）达到高峰。
MA在糖尿病患者中的发生率为30%到40%。1型糖尿病患者被确诊后的头5到10年里出现MA的情况并不多见；而MA在2型糖尿病患者中却很常见，这是因为2型糖尿病往往在发病多年后才被确诊。1或2型糖尿病一旦出现持续性MA，则此后每年的排泄都会增加4%到9%，在6到12年内通常会出现严重肾病。糖尿病患者约有25%到50%会出现明显的肾病，这在高血糖症和高血压未能得到有效控制的患者中更为明显，同时持续性的高血糖和与肾病相关的高血压也会进一步加重肾病。糖尿病性肾病是ESRD的主要原因，过去10年来2型糖尿病例的增多也使得ESRD持续增多。
高血压患者中的CVD在年龄超过45岁的2期或以上的高血压患者中，MA似乎与几种传统和非传统的心血管危险因素以及目标器官损害有着明显的联系。有几项研究表明，大约30%的轻中度高血压病人会出现MA；根据年龄和种族的不同，这个比例会在7%到40%的范围内波动。一些回顾性研究报道称伴有MA的高血压患者中发生CVD的比例要明显高于不伴有MA的高血压患者。在一项对11343位非糖尿病性高血压病人所做的大规模研究发现，伴有MA的病人出现下述情况的比例明显增高：
* 冠状动脉疾病（31%对22%）；
* 左心室肥大（24%对14%）；
* 中风史（6%对4%）；
* 外周血管疾病（7%对5%）。
伴有MA和CVD的病人其尿中白蛋白的量也显著高于无CVD的病人。
一般人群中的CVD在几项对大量人群所做的研究中，无论是对已经或还没有被诊断为糖尿病的人来讲，MA都已经被作为是CVD一个强有力的独立危险因素。例如：
* 在欧洲、北美和南美所做的一项研究发现，有MA出现时，定义为尿白蛋白与肌酐比率（ACR）≥2mg/mmol、并与其它风险因素对比调整后，发生心血管疾病（心肌梗塞、中风和心血管疾病导致的死亡）的相对风险（RR）为1.75；其它所有原因所致死亡率的RR为1.92；充血性心衰为2.42。此外，RR在伴有或不伴有糖尿病的群体中是相似的。ACR水平每升高0.4mg/mmol，发生心血管疾病的风险会增高5.9%。很显然，这种风险的增高开始于尿白蛋白浓度仅为0.5mg/mmol时，这就远低于目前所接受的用于诊断MA的测定起始值。
* 在丹麦进行的一项研究发现，没有被诊断为糖尿病的人出现MA时，如果ACR超过10%的范围或>0.65mg/mmol，则患缺血性心脏病的RR为2.3，这是一项独立的风险因素.
* 在荷兰进行的一项普通人群研究发现，UAC（尿白蛋白浓度）越高，心血管疾病和非心血管疾病所致的死亡率也就越高。升高两倍（如从5到10mg/L或从20到40mg/L）的UAC与心血管疾病所致死亡率的RR为1.29，与非心血管疾病所致死亡率的RR为1.12。在目前认为是正常UAC水平的情况下，UAC和心血管疾病及非心血管疾病死亡率的关联性就已经很明显了。
* 一项发表在美国肾脏病杂志上的研究报告揭示了美国人口中的MA发生情况。美国MA（尿ACR30到299mg/g）的发生率男性为6.1%，女性为9.7%。即使在没有糖尿病和高血压的人群中，MA也很常见。在没有糖尿病、高血压、CVD或血清肌酐水平较高的人群中，MA的发生率为5.1%。从40岁开始这一数值会增高。
MA的出现反映出了微血管和大血管的病变，这些病变不仅会影响肾脏、也会影响心血管系统。因此，对于早期肾病来讲，即使MA水平尚低于正常范围，对于CVD而言此时的MA水平已经是一个风险因素。MA已经和其它主要风险因素一道构成了CVD的风险因素，这些因素包括：高血糖、高血压、高胆固醇和吸烟等。
检测和治疗方针
美国糖尿病协会已经推荐了一个针对不同尿标本采集情况的MA范围（见表1）。首选的是晨尿，因为晨尿的采集对病人来说很方便，而且它能反映UAE每天的变化，同时由于其尿浓度较高，易于检测MA。ACR可以纠正尿排出量的变化，因而通常用于准确地预测24小时UAE。
美国糖尿病协会还推荐对1或2型糖尿病人进行MA筛查。因为刚患上1型糖尿病的人很少出现MA，所以应当对诊断为1型糖尿病的患者5年后开始每年进行检测。鉴于2型糖尿病的发病时间难以准确确定，因而一旦诊断为2型糖尿病，就应开始每年进行检测。有几项研究显示如果在初期就能检出MA，则采用普通的降血压治疗就能减缓甚至终止肾病和CVD的发生。有效的治疗包括血压和高血糖症的控制。高血压既可以促使糖尿病肾病的发生，同时它也是糖尿病肾病发生后的结果；此外高血压也是患有或没有患糖尿病的人发生CVD的一个风险因素。在1型糖尿病人中，MA的出现通常先于血压的升高；即使是2型糖尿病人，MA出现时也通常只是伴有轻中度血压升高。许多关于糖尿病性肾病治疗过程中药物疗效的研究报告指出，ACE（血管紧张肽-转化酶）抑制剂对1和2型糖尿病具有肾保护作用；ARBs（血管紧张素受体阻滞剂）对2型糖尿病人具有肾保护作用，可能对1型糖尿病人也有肾保护作用。ACE抑制剂和ARBs的肾保护作用不同于它们的降压作用。一项研究表明对糖尿病的心血管保护是通过抗蛋白尿效应实现的,与其它风险因素的改变无关。MA的诊断作出后，监控实验室检测结果不失为一种评价药物疗效的有效方式。
美国糖尿病协会推荐1和2型糖尿病人出现MA或白蛋白尿时，只采用ACE抑制剂或ARBs；该协会同时承认ARBs在1型糖尿病中的作用尚缺乏足够的研究支持。
MA的常规检测
包括检测条在内的各种半定量检测试剂已经被用来现场检测MA。如果MA检测为阳性，实验室将会对结果进行确认并进行准确的定量检测。事实上，目前实验室采用的方法也已经被用于评价半定量检测试剂的准确性。其中一种MA检测条是拜耳公司的Clinitek微蛋白检测条。它是将白蛋白结合到磺酞染料上，和肌酐形成具有过氧化物酶活性的铜-肌酐复合物，用于催化二异丙基-苯二氢过氧化物和3,35,5-四甲基苯反应。这两种反应均可显色，并可通过Clinitek50便携式尿生化分析仪判读，并报告白蛋白浓度：10、30、80或150mg/L；肌酐浓度0.9、4.4、8.8、17.7或26.5mmol/L（10、50、100或200mg/L）；相应的是ACR<30mg/g、30到300mg/g或>300mg/g。将此结果与参考实验室检测结果进行对比后表明：
* 在总共144份来自糖尿病和/或肾病患者的尿标本中，白蛋白浓度正常上限<20mg/L的情况下，该检测条的灵敏度为95.4%，特异性为78.9%。
* 在总共302份来自糖尿病患者的尿标本中，ACR正常上限<30mg/g的情况下，该检测条的灵敏度为79%，特异性为81%。
* 在总共200份来自儿童、青少年和青年1型糖尿病患者的尿标本中，白蛋白浓度正常上限<30mg/L的情况下，该检测条的灵敏度为89%，特异性为73%。
另一种MA检测条是Micral Test II检测条。它采用类似层析的方法，标记抗体为金标特异性抗体。尿白蛋白和金标抗体在检测垫上发生反应，形成肉眼可见的颜色，与色卡进行对比后得出不同的蛋白浓度，浓度范围分别为：0、20、50和100mg/L。将此结果与参考实验室检测结果进行对比显示：
* 在总共2228份来自糖尿病人的尿标本中，白蛋白浓度正常上限<20mg/L的情况下，该检测条的灵敏度为96.7%，特异性为71%。
* 在总共411份来自连贯性糖尿病人的尿标本中，白蛋白浓度正常上限<20mg/L的情况下，该检测条的灵敏度为93%，特异性为93%。
* 在总共96份来自糖尿病和/或肾病患者的尿标本中，白蛋白浓度正常上限<20mg/L的情况下，该检测条的灵敏度为97.1%，特异性为33.3%。
用于MA确认和检测的三种实验室方法为：免疫散射比浊(INA)、透射免疫比浊(ITA)和RIA。这三种方法的性能特征。
* 免疫散射比浊法(INA)：尿标本中的白蛋白与抗人白蛋白抗体接触后，产生抗原-抗体反应。来自该反应的光散射的增加可通过激光浊度仪进行测定，以得出MA浓度。
* 透射免疫比浊法(ITA)：尿标本中的白蛋白和结合在乳胶颗粒上的人白蛋白与可以使乳胶凝集的单抗相互竞争，其结果为凝集量与标本中的白蛋白量成反比。通过光度计测定凝集量来换算出MA浓度。
* RIA：尿标本中的白蛋白取代已经与抗体结合的同位素标记的人白蛋白。其结果为仍保留的和抗体结合的标记白蛋白量与标本中的白蛋白量成反比。“游离”和“结合”的标记白蛋白被分离后进行放射测定。将放射性计数与标准曲线进行对比后得出MA浓度。
很显然，检测糖尿病人尿白蛋白的这些实验室方法的对比结果显示不同方法存在着较大的差异。在一项研究中，INA得出的值比ITA测定值低大约三倍；这就意味着ITA测定白蛋白浓度为30mg/ml时（已经是MA），INA的测定可能只有10mg/ml（仍在正常范围）。另一些研究显示，RIA测定值比INA测定值低1.4倍，比ITA低6倍；而INA测定值要比ITA低1.6倍。
美国糖尿病协会建议如果一个实验室不适于进行MA筛查，那么可考虑采用上述的快速检测条，因为这类检测条如果由专业人员操作的话显示出能被接受的灵敏度（95%）和特异性（95%）。而美国国家临床化学学会则建议由于这类定性或半定量检测条为了最大限度地减少假阴性率，其灵敏度均超过了95%，因而应采用一种实验室方法对阴性和可疑结果进行确认。此外，该学会还建议白蛋白浓度在20mg/L正常上限的检测均应由实验室方法复检，以确保MA的测定。
来自两种检测条的评估数据表明，当MA浓度接近检测范围的极限时，这类检测可能难以满足作为糖尿病肾病风险因素的MA早期出现所需的检测要求。此外，如果MA浓度低于检测范围，这类检测也难以满足作为CVD风险因素的MA的检测要求。此时只能采用实验室方法进行MA检测。
然而近来一些报告发现以染料和免疫为基础的检测条以及以免疫为基础的实验室方法并不能检测出尿中所有完整的白蛋白，这就增加了MA检测的潜在假阴性结果。HPLC（高压液相色谱）可以检测所有完整的尿白蛋白，因而能显著降低这种潜在性，尤其是在检测糖尿病人的尿标本时。
HPLC新近的四个重要发现使得人们不得不重新考虑怎样在初期糖尿病肾病发生发展的最早期阶段对其作出诊断。首先，白蛋白在尿中是以各种成份的复杂混合物形式分泌的，这些成份包括起免疫反应的完整白蛋白、白蛋白片段、聚合体白蛋白和不起免疫反应的完整白蛋白。其次，初期糖尿病肾病中不起免疫反应的完整白蛋白会增加。第三，HPLC既可以检测起免疫反应的完整白蛋白，也可以检测不起免疫反应的完整白蛋白；而以染料和免疫为基础的检测条以及以免疫为基础的实验室方法只能检测分子量>12kDa的起免疫反应的完整白蛋白和聚合体白蛋白。最后，以染料和免疫为基础的检测条以及以免疫为基础的实验室方法大大低估了糖尿病患者的尿白蛋白浓度，因而有可能延误对初期糖尿病肾病的诊断与治疗。采用HPLC而不是常规检测条或实验室方法来检测糖尿病人MA的优势可通过近期的两项研究进行展示：
* 对115位糖尿病人和106位非糖尿病志愿者的尿标本检测表明，与HPLC相比，采用Clinitek微蛋白检测条检测MA（ACR≥30mg/g）的假阴性率在糖尿病患者中为42.9%。
* 同样对上述尿标本检测表明，与HPLC相比，采用透射免疫比浊法检测MA（ACR≥30mg/g）的假阴性率在糖尿病患者中为36.3%。由于志愿者的尿标本中不含有不起免疫反应的白蛋白，因而与HPLC相比，这一组的假阴性率为0%。
* 通过1型和2型糖尿病患者的尿标本检测对HPLC和常规RIA在MA检测中的分辨时间进行的确定显示：13年间从42位1型糖尿病患者中采集的511份尿标本分析表明有17位从正常蛋白尿发展成为MA，25位一直为正常蛋白尿；与RIA相比，HPLC的平均检出时间是3.9年（2.1到5.6年有95%可信区间）。对同期49位2型糖尿病患者的634份尿标本分析表明，有24位从正常蛋白尿发展成为MA，25位一直为正常蛋白尿；与RIA相比，HPLC的平均检出时间是2.4年（1.2到3.5年有95%可信区间）。
在对作为CVD风险因素的MA的检测中，HPLC与其它常规检测的对比效果尚需进一步明确。当糖尿病患者和非糖尿病患者出现MA时，说明其肾脏对白蛋白的渗透性增加，表明其发生了广泛的血管病变。因此，除非糖尿病患者和非糖尿病患者滤过白蛋白的生化过程不同，否则的话被分泌出的起免疫反应的白蛋白和不起免疫反应的白蛋白都会作为CVD和糖尿病肾病的风险标志物。
不管起免疫反应的白蛋白和不起免疫反应的白蛋白是否都会被分泌出来，作为CVD一个风险因素的MA仍可通过HPLC进行检测。首先，HPLC检测性能优越，在尿白蛋白水平为95.8mg/L、白蛋白检测极限为2mg/L的情况下，其批间变异系数为2.4%。第二，轻度糖尿病患者采用HPLC要比采用RIA能检出更多的MA；同样，HPLC对MA的检出率也高于免疫散射比浊。第三，HPLC的最低白蛋白检测值对于低浓度MA的检测至关重要，因为这将关系到初期肾病的诊断。
成本效益分析
常规检测条加实验室确认试验被认为是对糖尿病患者MA进行筛查的性价比最好的一种方式。然而在采用检测条测定MA时出现的假阴性情况却很少被人关注。漏检会增加患ESRD的风险，从而影响患者的生活质量和增大医疗费用的支出；而早期干预治疗可以减缓或中止ESRD的进展。所以在检测MA时，不论是采用检测条还是其它实验室方法，综合考虑检测成本效益以保证作为糖尿病肾病风险因素的低水平MA的检出才是最重要的。
参考文献（略）
作者简介：Douglas E. Busby, MD, MSc，美国预防医学会资深会员、独立医学作家。Robert C. Atkins, MD，澳大利亚墨尔本Monash医疗中心肾病科教授。
