环状RNA研究深度剖析（二）
目标circRNA的机制研究 a RIP-qPCR：挑选功能最为明显的1个circRNA做RIP-qPCR实验，检测circRNA是否与AGO2蛋白结合。（AGO2是circRNA发挥海绵作用的指示蛋白） b RNA pull down：对上述circRNA进行RNA pull down实验，拉下来的RNA进行定量PCR检测，检测生信预测中与该circRNA结合的10-20疾病miRNA。 c luciferase assay：根据上步结果为circRNA挑选3个左右的miRNA做后续荧光素酶实验(miRNA与circRNA表达趋势一致)，分别构建circRNA的荧光素酶载体，miRNA结合位点突变的荧光素酶载体。 将circRNA荧光素酶载体与3个miRNA mimics共转染至细胞，检测荧光活性，证明环状RNA和miRNA mimics的结合。 d miRNA功能实验：选定1个miRNA研究其对某一确定细胞表型和靶基因表达水平的影响（如：迁移）； e 恢复性实验：分别研究：单独转染nc mimics或单独转染miRNA mimics或单独转染环状RNA过表达质粒，及共转染环状RNA+miRNA mimics对某一确定细胞表型和环状RNA表达水平的影响。 f 回补性实验：敲除circRNA后，过表达靶基因，检测靶基因是否能逆转circRNA敲除导致的表型变化。
既然是真情回馈，那么小编在这儿就给大家透露一个更容易get的研究海绵机制的思路如下图。可以同时做一下circRNA-seq和AGO2 RIP-seq，这样重叠部分的结果便是可能发挥海绵作用的circRNA。进而通过RNA pull down-WB反向验证circRNA与AGO2的相互作用，其他功能实验与上述一致。
可如果我的circRNA不是海绵机制，咋办？别怕，小编给你出大招！ circRNA结合功能蛋白： 当你发现自己的circRNA不是发挥海绵作用的时候，是不是有种泪奔的感觉？ 别怕，小编这就给你吃一颗定心丸。原来circRNA不仅可以与miRNA结合发挥海绵作用，还可以结合功能蛋白发挥作用呢！下面这篇就是很好的例子！和大家一样，这篇文章的作者也是先通过AGO2 RIP实验验证了他的circANRIL是否结合AGO2，但不幸的是，结果证实他彻底的和miRNA海绵say goodbye了，顿时小编也是捏了一把冷汗。可作者竟然奇迹般地扭转了局势，通过RNA pull down探索了circANRIL上结合的蛋白，并通过RIP反向证实了circRNA是通过与PES1蛋白结合参与了rRNA的成熟过程。想来功夫不负有心人，这篇文章也是成功地发表在Nature communication上[5]。
circRNA顺势调控来源基因表达： 这里小编给大家准备了一个被掩藏许久了的环状机制：circRNA顺势调控来源基因表达的研究思路，即通过特异的RNA-RNA互作来调控转录。
这篇文献，作者首先通过CLIP-seq（检测RNA结合蛋白下游的RNA）发现RNA聚合酶II上结合了一些circRNA。并且通过鉴定，发现是外显子与保留在外显子之间的内含子形成的环状RNA，命名为外显子-内含子circRNAs（EIciRNAs），其中显著富集的circEIF3J和circPAIP作为后续研究对象。研究这通过FISH定位发现其定位于细胞核，这提示作者可能不能走miRNA海绵的路子了。So what？ 作者通过反义核苷酸技术沉默circEIF3J和circPAIP后检测来源基因表达，证实了其可调控来源基因表达。RNA-DNA共定位FISH也证实EIciRNAs与其来源基因共定位于细胞核中。此外这两个EIciRNAs与Pol II互作关系也都使作者提出一个大胆的猜想：EIciRNAs可能对其来源基因有调控作用。 带着这样的猜想，接下来作者先后通过RNA pull down（检测RNA与RNA/蛋白作用）和CHIRP（是一种检测与RNA绑定的DNA和蛋白相互作用的方法。）实验分析了与两个EIciRNAs相互作用的蛋白及RNA。结果发现EIciRNAs不仅可以与Pol II结合，还与U1A和U1C snRNP结合（它参与真核生物细胞核中RNA的加工。snRNA和许多蛋白质结合在一起成为小核核糖核蛋白(snRNP即small nuclear ribonucleoproteins)，参与信使RNApre-mRN的剪接，使后者成为成熟mRNA。），且在细胞核内互作（FISH）。CHIRP实验证实EIciRNAs同Pol II、U1 snRNP共同结合于其来源基因转录起始位点上游300bp处，并且U1 snRNP的结合是必需的[8]。
circRNA翻译蛋白质： 假如这一切都不足以吸引你的眼球，那么接下来的这个案例可能会让你“跌破眼镜”。最初我们认为circRNA属于非编码RNA，不能发挥编码蛋白质的功能，那么事实真的如此么？Cell Research[3]这篇文章便告诉你：大错特错！环状RNA没有游离的5’和3’端，因此如果可以翻译的话一定是通过不依赖于5’帽子结构的方式。根据目前报道的环状RNA翻译蛋白的调控元件包括IRES和m6A修饰两种途径。
已知一些mRNA可以不依赖于帽子结构而靠一个叫内部核糖体进入位点(IRSE)的顺式调控元件来从mRNA的中间启动翻译，作者基于这种思想，检测发现自己的环状RNA上并没有IRES，却同样可以翻译蛋白。然而一直有报道称m6A可调控翻译，但并没有系统的研究，作者大胆猜想是否环状RNA上也发生了m6A修饰，并调控蛋白翻译呢？
结果不出所料，环状RNA的翻译可被RNA甲基化酶调控。作者通过一系列实验证实YTHDF3可识别circRNA上发生的m6A修饰，并招募翻译起始因子eIF3A和eIF4G2等，起始蛋白翻译。
说道翻译蛋白质的研究思路，稍微复杂一些，那么小编给大家总结一下。 1. 翻译启动元件预测分析： IRES是internal ribosome entry site的简写，是一种具备募集核糖体并实现核糖体组装和后续阅读框翻译蛋白的RNA调控元件。 2. 阅读框预测： 阅读框是Open Reading Frame的简写，指在核酸序列中从ATG开始（RNA中是AUG），三个碱基一组，直至出现TAA，TAG或TGA（RNA中A变成U）终止密码子的序列。 3. 载体表达验证实验： 通过构建正常元件和元件突变载体，即把预测到的IRES或m6A修饰位点突变掉，看后续的翻译是否正常进行。 4. 阅读框表达验证实验： 通过在原有的阅读框前端增加标签序列，包括3×Flag等标签，验证阅读框产物在生理条件下是否可以实现。 5. 内源性翻译产物鉴定： 通过制备特异性抗体进行Western等检测实验。这部分需要进行抗体特异性证明实验，包括模拟翻译产物的过表达和敲除实验等，特异性可以通过WB和IP下来质谱鉴定。 6. 核糖体结合分析： 基于蔗糖密度梯度离心的核糖体分离技术，鉴定环状RNA上是否结合核糖体，以及结合的多少。 7. 翻译产物过表达和敲低（除）实验： 通过构建过表达或敲低/敲除体系，看不同含量的翻译产物对细胞生理指标的影响情况。 3.环状RNA项目国自然申请建议 (1)避免单纯设计表达谱的研究内容。尽早进行表达谱分析，找到有研究价值的目标环状RNA，并开展一些简单的验证实验，最好能形成大致的功能机制研究的轮廓。 (2)开展新颖的环状RNA研究方向。包括对尚未报道或极少报道的病理或生理模型相关的环状RNA筛选鉴定，或者机制研究方向上，比如miRNA海绵，与功能蛋白相互作用，与表观水平结合，翻译蛋白质方向等。 (3)利用多种有效地分析环状RNA与其他分子或蛋白相互作用的研究工具。包括RIP，RNA pull-down，CLIP等实验技术，如果能得到有效数据，会在国自然科学基金申请中增色不少。 参考文献 1.Memczak S, Jens M, Elefsinioti A, et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency.[J]. Nature, 2013, 495(7441):333. 2.Hansen TB, Jensen TI, Clausen BH, et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges[J]. Nature, 2013, 495(7441):384-388. 3.Yun Y, Fan X, Mao M, et al. Extensive translation of circular RNAs driven by N6-methyladenosine[J]. Cell Research, 2017, 27(5):626. 4.Zheng Q, Bao C, Guo W, et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs[J]. Nature Communications, 2016, 7(11215):11215. 5.Holdt L M, Anika S, Kristina S, et al. Circular non-coding RNAANRILmodulates ribosomal RNA maturation and atherosclerosis in humans:[J]. Nature Communications, 2016, 7:12429. 6.Legnini I, Timoteo G D, Rossi F, et al. Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis[J]. Molecular Cell, 2017, 66(1):22. 7.Yang Y, Gao X, Zhang M, et al. Novel Role of FBXW7 Circular RNA in Repressing Glioma Tumorigenesis.[J]. Journal of the National Cancer Institute, 2018, 110(3). 8.Li Z, Huang C, Bao C, et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus.[J]. Nature Structural & Molecular Biology, 2015, 22(3):256.
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