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Nature综述丨冷冻电镜在药物发现中的应用前景

2018.7.03

  1前言

  近日,欧美多国科学家在Nature Reviews Drug Discovery杂志发表了题为Cryo‑EM in drug discovery: achievements, limitations and prospects的重要综述,系统阐述了Cryo-EM(Cryo-electron microscopy)的前世今生,以及它在药物筛选方面的应用前景【1】。

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图片来源网络

  众所周知,2017年诺贝尔化学奖授予了三位杰出的生物物理学家Jacques Dubochet、Joachim Frank和Richard Henderson,以表彰他们在Cryo-EM发展过程中的推动性贡献。有了他们,众多生物学家的工作才如行云流水,探囊取物似的发文(特约评论丨2017年诺贝尔化学奖评述——冷冻电镜技术获奖并不意味着该技术已经成熟)。

  结构生物学似乎一直被很多人,甚至被很多“吃瓜群众”所诟病。不少人认为结构生物学就是“灌水+搬砖”,觉得结构生物学领域发高水平文章很容易,其实不然。外行看结构生物学,可能大部分仅停留在结构表面,对结构生物学的应用和对科学问题的阐述缺乏深入的了解和认识。颜宁老师曾说过,“拿到一个结构只是一个起点,从结构里去发现大自然的奥秘才是结构生物学的精髓所在!”

  其实结构生物学的重要性毋庸置疑,这一点可以从近几年(如2003、2006、2009、2012)的诺贝尔奖直接授予结构生物学家看出。这些诺贝尔奖获得者也并非一直从事结构生物学研究,比如说2012年诺贝尔化学奖得主Brian K. Kobilka最初从事细胞生物学,后来转行从事结构生物学研究分子机制 (https://www.nature.com/-news/2011/110824/full/476387a.html),因为他觉得他的科学问题只有结构生物学才能解答,才能从原子水平解释G蛋白偶联受体(GPCR)的分子机理。另一方面,结构生物学在药物筛选中也起着举足轻重的作用。

  2三足鼎立的时代

  目前的结构生物学的三大手段分别是X-ray晶体衍射、核磁共振(NMR)和Cryo-EM。X-ray晶体衍射在这三种方法中一直是占主导地位,在PDB数据库中,晶体结构大约占总数的90%,NMR结构占9%,剩下EM结构仅占不到1%(图1)。尽管如此,这三种技术各自有各自的优势和地位。

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图片来源网络

  X-ray晶体衍射主要覆盖的蛋白分子大小在10-150 kd,超过150 kd的晶体结构非常少,不过大部分蛋白都在这个分子量范围内。该技术经过几十年成熟的发展,已经解析了12万多个蛋白结构,如今想找一个容易结晶的重要蛋白可不易。

  NMR技术主要覆盖的蛋白分子小于50 kd,可以直接对溶液中的蛋白进行结构解析;不过它对蛋白的表达量和稳定性要求很高,所以可以继续深入发掘的潜力有限。

  Cryo-EM技术近些年来才兴起,经过近几年的飞速发展,倒是大有取代X-ray晶体衍射方法之势【2-4】(0.73Å,最高分辨率的结构揭示淀粉样聚集蛋白功能性可逆的精密调控分子机制)。不过目前来说,Cryo-EM的蛋白结构主要是大于150 kd的大蛋白或复合物,而且分辨率3 Å以下的还是少数,但是这一现状正在改观。

  图1. 结构生物学三种方法解析的结构比例

  3结构生物学在药物筛选中的应用

  结构生物学一直在药物设计中扮演着重要的角色,它可以用于临床前药物设计的每一步,包括药物靶点的设计和鉴定,先导化合物优化等。由于能提供直接的证据,所以往往在筛药初期,可以对药物设计提供可靠的靶点,为小分子药物指明方向;在后期,直接提供结构生物学的证据,起到画龙点睛的作用。

  结构生物学的三大方法对药物设计均有很大的帮助,但是也各自有各自的优缺点。X-ray晶体学是目前来说最高效、最强大,也是实际作用最大的方法,当靶点是可结晶的蛋白,一旦强大的结晶系建立,就可以快速和可重复地产生高分辨率结构,就可以源源不断的对蛋白进行位点突变或药物设计了;核磁共振(NMR)允许快速识别和分类,并提供有关系统动态的信息,但是该方法本身受到很多因素的限制,比如目标蛋白的覆盖范围不是特别广泛;Cryo-EM允许在溶液中确定大的和/或动态的大分子复合物的结构,而不需要获得晶体,甚至在它们的天然状态下即可实现,比如翻译后修饰的状态;此外,由于蛋白在接近天然状态下的溶液中是高度动态的,所以蛋白的不同构象状态可以在一个实验中解决。

  Cryo-EM已经证明了其在靶标鉴定、验证等方面的实用性,通常涉及目标结构分析,以理解作用机制和评估可药用性。该分析需要参考天然的结构,理想情况下会结合其他方法的结果作为参考。自20世纪90年代以来,Cryo-EM已与X-ray晶体学结合使用了几十年,以解决不易结晶的大型复合物的结构。从EM密度图的轮廓获得的低分辨率分子包络(通过使用与对象的分子质量相关的阈值以去除与噪声对应的三位像素)可以给高分辨率晶体结构域、个别蛋白质或复合体提供近似轮廓,可与X-ray晶体学相辅相成。

  结构生物学在药物开发中的应用,最好的例子当属GPCR了【1, 5, 6】。在2007年GPCR结构解析之前,药物筛选基本上就是处在盲筛和半盲筛的阶段。有了晶体结构之后,临床药物的开发迅速发展,上市药物也全面发展(图2)。

  图2. a.近年来GPCR的临床阶段中的药剂数量;b. 每种受体配体类型在所有结晶GPCR中的比例 【6】

  4Cryo-EM技术的历史与现状

  1931年,Max Knoll和Ernst Ruska发明了电子显微镜,并在1933年第一次打破了光镜的理论极限,使人类能够看到更加细小的颗粒。在发明之初,电镜并不被看好被用于对生物样品的观测。因为两个基本的问题摆在生物学家面前:一是电镜成像时,需要在真空中;二是成像时电子的辐射对生物样品的损伤很大。所以在之后的几十年里,科学家仅仅是用它做一些细胞形态学、病毒颗粒之类的负染,除此外,电镜在生物领域的贡献不太大。

  但是技术瓶颈总是阻挡不住科学家求真的脚步!1981年,Jacques Dubochet和他的同事在电镜技术上取得了突破性进展——他们将快速冷冻的方法引入其中,即,将单个分子快速冷冻在单层的玻璃态的水(或者叫无定形的冰,vitrified water)中,即可解决上述两个基本问题。玻璃态化(Vitrification)的过程不仅可以使样品保持天然的状态,还可以保护样品在低温成像时免受脱水的危险,而冷冻本身也减少了由电子束引起的伤害。

  尽管如此,在当时,要使电镜成像达到原子分辨率水平,还依然面临诸多挑战。比如说低信噪比、如何将2D成像转化为3D结构等问题。Joachim Frank和他的同事率先使用计算图像处理技术(computational image processing techniques),利用多个成像生物大分子拷贝的计算平均来改善信噪比的问题,得到不同角度的2D图像,再利用计算机软件进行3D重建,解析蛋白质的结构。近些年来众多的设备改善也极大促进了Cryo-EM技术的发展,比如高自动化程序的软件开发、高性能charge-coupled device(CCD)相机的应用等。正是由于这些技术的使用,Cryo-EM的应用才越来越广泛。

  从电镜发明开始至今,解析的生物样品的结构大约有2200个(蛋白结构、病毒颗粒等)。1968年,第一个电镜结构被解析;1981年,有了冷冻样品的电镜技术;1999年,使用电镜技术解析的ribosome分辨率达到7.5 Å 【3】。大约2000年之后,电镜结构的数量开始逐年增长,但那时的分辨率一直不佳;而在2010年之后,用电镜技术解析的生物样品结构开始井喷式增长,2010年首次超过50个,分辨率也接近原子分辨率或近原子分辨率。目前总量已经接近2200个(图3) 。相信未来增长的势头会更加迅猛。

  图3.Cryo-EM结构增长情况。数据来源于PDB数据库,截至2018年6月13日)

  5Cryo-EM技术在药物筛选中的应用前景

  最近,单颗粒Cryo-EM为不适合结晶的蛋白提供了高分辨率结构,包括大型动态复合物和膜蛋白,技术进步使得Cryo-EM可用于研究更小的物体和分辨率更高的物体,包括与小分子的复合物。本节将通过几个例子重点介绍具有药物发现相关性的Cryo-EM结构。

  5.1膜蛋白

  GPCRs。GPCRs是最丰富的细胞表面受体蛋白,并且被市场上约30%的药物所靶向 【5, 6】。尽管GPCR的X-ray晶体学研究取得了重大进展(这在历史上一直是非常具有挑战性的),但由于需要获得高质量晶体和纯化过程中相对较低的稳定性,X-ray对该家族的一些成员仍然难以应付。然而,cryo-EM可以确定GPCRs的不同构象以及与G蛋白复合物的结构,从而用于配体筛选或设计药物。以前,构象不稳定且不能结晶的大复合物无法成像,Cryo-EM则使其成为可能。2016年,单颗粒cryo-EM解析了第一个GPCR的cryo-EM结构(4.1Å),确定了激活状态下鲑降钙素、G蛋白和人降钙素受体(B类GPCR)的异源三聚体结构【7】。此后不久,结合兔胰高血糖素样肽(glucagon-like peptide 1, GLP1)、G蛋白和GLP1受体(B类GPCR)4.1 Å的cryo-EM结构被解析,解释了B类受体如何通过激素活化结合【8】。人类GLP1受体结合的激动剂和G蛋白异源三聚体的3.3 Å的Cryo-EM结构,给出了偏向激动作用(biased agonism)的见解【9】(图4)。分子量为150 kDa时,这种重要的药物靶点曾经被认为几乎不可能在近原子分辨率下使用cryo-EM成像,直到最近这些GLP1受体结构被解析出来。这些结构侧链清晰可辨,可帮助设计治疗II型糖尿病和肥胖症的新药,同时也为以后的更高分辨率GPCR蛋白复合物的解析提供了很好的样本范例。

  图4. 偏向信号(Biased signalling)可以通过三种通用机制进行编码【5】

  γ-分泌酶(γ-secretase)。γ-secretase是涉及淀粉样-β肽裂解的四组分170 kDa的膜内蛋白酶。γ-secretase的功能障碍是促进早发性阿尔茨海默病(AD)患者大脑中淀粉样斑块形成的原因,因此科学家有兴趣将其作为潜在的药物靶标。γ-secretase也作为Notch信号传导的关键介质参与癌症。在分辨率为3.4 Å的γ-secretase的cryo-EM结构中发现,四跨膜束内核(core of a four-transmembrane bundle)的两个热点突变,削弱了蛋白酶活性,从而引起早发性阿尔茨海默病。这个原子模型可以帮助设计更具选择性的化合物。值得注意的是,γ-secretase糖基化对Cryo-EM数据集的结构重建几乎没有影响,而它却可能妨碍X-ray的结晶【10】。

  离子通道。各种离子通道结构已经在不同的分辨率下得到了解决,包括几种潜在的药物靶标。 这些包括:瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员1(TRPV1)【11-13】和TRPA1【14】通道,它们分别参与传感和传导温度和刺激物;电压门控钙通道Ca v1.1【15】和钠通道NavPaS【16】,它们分别涉及骨骼肌组织的收缩以及可兴奋细胞中动作电位的产生和传播。被解析的通道蛋白还有很多,特别要指出的是,冷冻电镜最近对TRP家族中的通道蛋白研究产生了巨大的影响,在过去的4年中,约解析出了50个冷冻电镜结构。历史上,获得良好衍射的TRP通道晶体非常困难,因为它们在细胞中的基因表达水平低,并且对化学和物理刺激非常敏感。结合激动剂的TRPV1(2.9 Å)【13】,TRPML3(2.9 Å)【17】和TRPM4(2.9 Å)【18】结构是目前为止由Cryo-EM解析的膜蛋白的最高分辨率结构。同样重要的是,Cryo-EM在研究极大离子通道复合物也具有无可估量的价值,如Ryanodine受体(RyRs)【19, 20】,它们是已知最大的离子通道之一,质量为2.2 MDa,介导细胞内Ca2+释放并且是心脏疾病的新兴治疗靶点。这些解析出来的离子通道蛋白结构,将成为药物设计的重要靶点,同时也再次证明了Cryo-EM技术的强大。

  ATP结合蛋白(ABC)转运蛋白。Cryo-EM也揭示了X-ray衍射难以处理的其他膜蛋白复合物的结构。例如解析并阐明真核ABC转运蛋白多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance-associated protein 1, MRP1)识别底物以及底物结合如何刺激ATP水解的机制【21】。ABC转运蛋白在多种药物的吸收,分布,代谢和消除中发挥关键作用,可导致药物相互作用,因此,有关其结构的信息可能对药物开发同样具有重要价值。

  5.2抗体和疫苗

  要理解潜在生物治疗剂作用机制,必须通过表位作图分析阐明单克隆抗体(mAb)的活性。近年来,负染和cryo-EM已用于抗体的线性和构象表位作图。该方法仅需要微克量的抗体-抗原复合物,并且可以与其他表位定位技术结合使用,如氢-氘交换质谱(HDX-MS)或蛋白的快速光化学氧化(FPOP)技术。在最近的例子中,Long和他的同事使用cryo-EM阐明了病毒中和人mAb是如何结合病毒样颗粒,并阻断病毒和宿主膜融合的机制的【22】。Ciferri及其同事使用负染技术研究与HTRA1(一种与年龄相关的黄斑变性有关的丝氨酸蛋白酶)形成独特复合物并抑制其酶活性的抗体的结构【23】。该研究突出了IgG-HTRA1复合物的笼状结构,其较不紧凑的螺旋桨状排列,具有比Fab对应物更高的效力【23】。使用新的cryo-TEM技术可以进一步使表位作图更高效地辅助mAb设计。在抗体疫苗研究中使用cryo-EM的报道还有不少,该技术在研究动态目标中起着非常大的作用。

  5.3潜在的先导化合物优化

  目前药物研发人员非常感兴趣的一个问题是,Cryo-EM是否可用于药物设计的命中导向和前导优化阶段,这往往依赖于基于结构的药物设计(structure-based drug design,SBDD)。为了使SBDD在这些阶段发挥作用,在短时间内(与候选药物开发时间相比)快速而夯实地产生多种结构的流程是先决条件;而当目标可以结晶时,高通量X-ray晶体学一直是黄金标准——用一系列化合物与蛋白共结晶或浸泡法来产生共晶体,再通过同步辐射光源进行衍射数据收集,以高通量自动化方式进行分子置换和配体模型构建,产生多重化合物-靶标复合物的结构。为了有效利用结构信息进行药物设计,分辨率理想情况下应该小于2.5 Å。

  尽管最近在Cryo-EM方面解析的靶标复合物结构分辨率能够低于3 Å,但它还远没有X-ray高效。例如,一个限制是获得高分辨率Cryo-EM结构所需的时间框架仍然比X-ray晶体学慢几个数量级。尽管如此,一些例子说明了如果可以解决这些限制,Cryo-EM的潜力将是非常可喜的。Merk和他的同事确定了异柠檬酸脱氢酶(93 kDa)的3.8Å分辨率下的cryo-EM结构,并在结构上表征了小分子抑制剂结合引起的构象变化。Wong和他的同事确定了结合抗原生动物药物吐根碱【24】和甲氟喹【25】的恶性疟原虫80S核糖体的Cryo-EM结构,并且分辨率都达到了3.2 Å。

  尽管在设计新的先导化合物中使用Cryo-EM的例子尚未见报道,但一些有希望的结果和正在进行的技术改进表明,Cryo-EM很快将被考虑作为SBDD的一个关键工具,特别是对难以结晶的目标,如膜蛋白。随着Cryo-EM产生的近原子分辨率结构的比例增加,相信制药行业的兴趣和期望也会越来越高。

  5.4其他蛋白

  除了膜蛋白之外,Cryo-EM在获得对神经退行性疾病靶标蛋白的结构理解方面也取得很多进展。最近的成功例子是,从阿尔茨海默病患者的脑中分离出了第一个高分辨率结构(3.4-3.5Å)的tau蛋白细丝【26】,其特征是成对螺旋丝(PHF)和直丝(SF)组成的神经原纤维tau聚集体。PHF和SF的Cryo-EM结构揭示了tau聚集体分子构象异构之间的差异,发现了异构体如何被掺入到长丝中。这些细丝的高分辨率结构测定开启了基于结构的药物发现的新的可能性,例如设计特定的抑制剂。

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