耐亚胺培南鲍曼不动杆菌的耐药性分析及金属β-内酰胺酶2

　1.1.3  仪器和试剂 

　　全自动微生物鉴定系统VITEK 2为法国生物梅里埃生产；水解酪蛋白(MH琼脂)为OXID公司产品；乙二胺四乙酸(EDTA)为重庆化学试剂厂产品。

　　1.2  方法

　　1.2.1  药敏试验 

　　采用K-B纸片扩散法。严格按照临床实验室标准化研究所(CLSI)推荐的纸片扩散法测定多种抗生素的抑菌环直径，按CLSI2008年M100-S18规定折点判断耐药(R)、中介(I)及敏感(S)[4]。数据分析采用WHONET5.4软件；数据的统计分析采用卡方检验，以P<0.05为有显著性差异。

　　1.2.2  纸片法测定MBLs 

　　根据文献[5-6]略做改进，采用两种方法检测。①头孢他啶+2-巯基丙酸： 将待检菌株按常规药敏均匀涂布于MH平板，分别贴两片头孢他啶纸片，纸片中心相距2.5cm，其中一片加入3μL 2-巯基丙酸原液；在另一侧贴空白纸片，其中一片也加入3μL 2-巯基丙酸原液，35℃孵育18～24h。若加试剂的纸片抑菌环直径扩大4mm以上则为阳性，提示产MBLs。②亚胺培南+EDTA法：0.5麦氏单位待测菌菌液均匀涂布MH琼脂平板，中间贴亚胺培南和头孢他啶纸片，纸片相距4cm。 在距纸片1.5cm处分别贴一空白纸片，均匀加入0.5mol/L EDTA 10μL，35℃培养过夜。若两纸片有协同作用，为产金属酶株。

　　2  结 果

　　2.1  菌株分布 

　　91株鲍曼不动杆菌中，来源于痰标本(主要为无菌吸痰和支气管灌洗液)76株(83.5%)、尿标本2株(2.2%)、伤口分泌物5株(5.5%)、腹腔引流液3株(3.3%)、静脉导管尖端3株(3.3%)、血液标本2株(2.2%)；按病区分布，中心ICU 62株(68.1%)、呼吸RCU 8株(8.8%)、呼吸科10株(11.0%)、神经外科ICU 8株(8.8%)、肝移植科3株(3.3%)；耐亚胺培南IMP鲍曼不动杆菌分布，ICU 20株(86.9%)，非ICU 3株(13.0%)。结果显示，呼吸道标本远高于其他，而且ICU病房分离率远远高于其他病区。

　　2.2  药敏结果 

　　91株鲍曼不动杆菌分为亚胺培南敏感组(68株)和耐药组(23株)，耐药组的药敏结果显示，敏感率较高的抗生素有阿米卡星(78.3%)和米诺环素(65.2%)，其次为头孢哌酮/舒巴坦(43.5%)、哌拉西林/他唑巴坦(34.8%)和环丙沙星(30.4%)，对其他抗生素氨苄西林/舒巴坦、复方磺胺、头孢他啶、庆大霉素几乎全部耐药(表1)。按文献[1]将对亚胺培南、头孢他啶、环丙沙星或阿米卡星三个或三个以上耐药的细菌称为多耐药菌(MDR)，本实验中MDR多重耐药发生率达到58%。与亚胺培南敏感组比较，除阿米卡星、环丙沙星、米诺环素外，亚胺培南耐药组对所有抗生素的敏感率降低、耐药率增高(P<0.05)。表1  鲍曼不动杆菌对各种抗菌药物的敏感率和耐药率（略）与亚胺培南敏感组比较，*P<0.05。

　　2.3  MBLs检测结果 

　　用头孢他啶+2-巯基丙酸法检出产金属酶12株(52.2%)，亚胺培南+EDTA法检出10株(43.5%)，两种方法同时阳性8株，头孢他啶+2-巯基丙酸法单独阳性4株，亚胺培南+EDTA法单独阳性2株，头孢他啶与EDTA有协同作用1株(图1)。
　
　　3  讨 论

    随着碳青霉烯类抗生素的广泛使用，耐亚胺培南的鲍曼不动杆菌的报道逐年增加[7]，国内外均出现耐亚胺培南不动杆菌耐药克隆株的暴发流行[1,3]。在西班牙，不同医院耐亚胺培南的不动杆菌的分离率为13.5%～85%，平均为44.9%，并对多种抗生素耐药[8]。本研究数据显示，我院耐亚胺培南的鲍曼不动杆菌的分离率为25.3%，多重耐药的鲍曼不动杆菌达到58%，明显高于2006年国内监测数据21.9%和53%[9]。可能与我院大量使用碳青霉烯类抗生素治疗感染有关。在所分离的菌株中，呼吸道标本占83.5%，远高于其他类型标本，而且主要集中在ICU病房，说明鲍曼不动杆菌是呼吸道感染的主要病原菌，与院内获得性呼吸系统感染尤其是机械通气关系密切。对于耐亚胺培南的鲍曼不动杆菌，抗菌活性较好的有阿米卡星、米诺环素、头孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦。有报道，多粘菌素对耐亚胺培南的鲍曼不动杆菌有很好的抗菌活性。

    细菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制主要是产生碳青霉烯酶。碳青霉烯酶是指能够水解亚胺培南或者美罗培南的一类β-内酰胺酶，包括Ambler分类中的A、B、D三类酶[10]，在不动杆菌中发现的碳青霉烯酶主要为B类和D类酶[1-2,11]，D类为苯唑西林酶(OXA类酶),B类为金属酶，属于Bush分群的第三组，由于β-内酰胺酶活性位点有Zn离子的参与，故称金属酶。目前国内外已发现的鲍曼不动杆菌中的金属酶主要有IMP-型和VIM-型[12]。金属酶的出现令临床治疗陷入困境，主要原因为：它具有广泛水解包括碳青霉烯类在内的β-内酰胺类抗生素的能力，而且对常用的β-内酰胺酶抑制剂如克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦敏感性差；产酶基因大多由质粒、转座子或整合子等可移动元件介导, 易于传播；不动杆菌中，碳青霉烯酶基因、氨基糖苷修饰酶基因通常位于一个整合元件中而介导多重耐药[13]。本研究结果也证实了这一点，耐亚胺培南的鲍曼不动杆菌，对多数抗生素如头孢类、庆大霉素等耐药，多重耐药的检出率也非常高(约60%)。