邹鹏/王建斌合作发展空间特异性RNA标记技术
真核细胞转录组在三维空间中的分布特征对于基因表达具有重要调节作用。在记忆形成、胚胎发育、细胞增殖等一系列生理学过程中，细胞通过将特定RNA分子选择性富集在亚细胞区域，能够实现对蛋白质翻译过程的精准调控，或帮助建立和维持染色体三维结构。因此，发展一种能在转录组层面解析细胞中RNA三维空间定位的方法，对于深入理解RNA功能具有重要意义。
传统研究手段往往依赖于针对细胞器的机械分离技术，例如利用密度梯度离心法纯化细胞核、线粒体、突触小体等亚细胞结构，进而通过高通量测序分析样品中RNA成分。这类技术的通常局限于那些具有稳定膜结构的细胞组份，而难以有效分离无膜包被的细胞区域（例如线粒体外膜）。近年来，随着超分辨成像技术的进步和细胞原位测序方法的发展，人们已能够对细胞内上千种RNA分子同时进行成像观测。然而目前基于成像的手段依然受限于空间分辨率和分析通量，而且依赖于已知RNA序列。因此，我们迫切需要一种具有高时空分辨能力、适用于活细胞的空间转录组研究技术。
2019年10月7日，北京大学邹鹏团队联合清华大学王建斌团队在Nature Chemical Biology杂志上发表长文Mapping spatial transcriptome with lightactivated proximity-dependent RNA labeling，发展了一种基于光敏化学反应的空间特异性RNA标记技术。利用可遗传定位的光敏蛋白质miniSOG在细胞中原位产生活性氧自由基，短时间内对附近的RNA进行化学修饰，随后从细胞中提取和纯化修饰的核酸，并利用高通量测序技术检测标记位点。该方法可实现在细胞天然环境下标记线粒体、内质网等重要细胞器附近的RNA分子。经过富集和高通量测序鉴定，实现在全转录组水平上分析RNA成分，并在此基础上发现了协调线粒体-细胞质蛋白质翻译的新机制。
研究人员首先在体外实验中比较了各类光敏分子在可见光照条件下对核苷的氧化损伤能力，挑选出可遗传编码探针miniSOG。在蓝光照射下，miniSOG产生的单线态氧迅速进攻鸟嘌呤，生成的氧化中间体被含有氨基的探针捕获形成共价加成产物。研究人员将这一方法命名为Chromophore-assisted proximity labeling and sequencing，简称CAP-seq。由于单线态氧扩散距离有限，该反应只在miniSOG附近几十纳米范围内发生，具有良好的空间特异性。为了验证这一点，研究人员将miniSOG表达在线粒体基质，成功捕获了线粒体中全部15个长链RNA，而没有富集到细胞质中的高丰度RNA。
研究人员进一步将CAP-seq方法扩展到研究内质网表面与线粒体表面的转录组。在内质网膜附近CAP-seq捕获的372个mRNA中，高达96.2%编码分泌途径蛋白或膜蛋白。这一结果与内质网表面的蛋白质局部翻译模型一致，证明了CAP-seq在开放的细胞质空间中也具有高空间分辨率。接下来，研究人员应用CAP-seq技术对哺乳动物细胞线粒体表面的转录组进行了解析。研究人员捕获到的411个mRNA中，27%编码线粒体蛋白质，多达50%定位于线粒体内膜上，并且其中有33个为氧化磷酸化途径相关蛋白。这些结果支持了线粒体蛋白在线粒体外膜被翻译后直接转运进线粒体的模型。同时还发现了多达62个编码胞质核糖体蛋白的mRNA，暗示着哺乳动物细胞中线粒体-细胞质蛋白质翻译可能通过调控编码胞质核糖体蛋白亚基mRNA在线粒体表面的局部翻译来实现。
总之，本文主要发展了在活细胞中空间特异性标记RNA的化学生物学新技术CAP-seq。由于miniSOG分子量约为GFP的一半，可以较容易通过蛋白融合手段定位于感兴趣的亚细胞区域，标记所需的小分子探针也能很容易扩散进入细胞，光控标记具备优良的时间分辨能力，因此CAP-seq具有广阔的应用前景。
专家点评
何川（HHMI研究员、芝加哥大学化学系终身教授 、John T. Wilson Distinguished Service讲席教授）
自从2013年Alice Ting实验室报道了基于APEX的线粒体蛋白组学分析技术以来（Science, 2013, 邹鹏为共同第一作者），以临近标记技术为基础的亚细胞水平蛋白组学分析已经推动了细胞增殖分化等多个领域的研究发展。蛋白质的亚细胞定位受多个层面因素的调控，除了蛋白质的定向转运以外，基于mRNA定向分布的蛋白质翻译空间调控也是重要环节。然而，能有效标记RNA的化学手段非常有限。由于技术的限制，针对mRNA的亚细胞水平分析一直未曾实现。今年早些时候，Alice Ting实验室(Cell, 2019)和邹鹏实验室(Angew Chem Int Ed, 2019)分别报道了经过优化的基于APEX的RNA临近标记技术，但标记效率较早前的蛋白质标记还有很大差距，影响了其在实际研究中的应用。
今天上线的这篇文章中，来自北京大学邹鹏实验室和清华大学王建斌实验室的研究人员基于一个新的临近标记酶miniSOG开发出了针对RNA的高效标记技术。这一新化学标记技术利用miniSOG产生的自由基和鸟嘌呤反应，跳出了原有APEX体系的限制，可以更加精确的控制标记区域，有效区分线粒体基质和外膜区域的RNA组成。此外，在本篇文章中，研究人员还发现核糖体蛋白mRNA的空间定向分布，预示着除了mRNA空间分布和蛋白质定向运输之外，翻译效率的定向分布也是影响细胞内蛋白质分布的重要因素之一。相信这篇文章介绍的基于自由基的标记方法将引领一批相关技术开发的热潮，同时进一步推进多个领域的快速发展。
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