在小鼠ELISA试剂盒中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下倒置混和，不要在混匀器上强烈振荡。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清天然凝固、血块收缩后即可取得。也可在板孔中加入稀释液，再在其加入血清标本，然后在微型震荡器上震荡1分钟以保证混和。一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。血清标本可按常规方法采集，应留意避免溶血，红细胞溶解时会开释出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的小鼠ELISA试剂盒测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。如在冰箱中保留过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。本文将叙述板式ELISA各个操纵步骤的留意要点，珠式、管式及磁性球ELSIA，国外试剂均与特殊仪器配合应用，严格遵照划定操纵，必能得出正确的结果。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并留意不可溅出，不可产气愤泡。有此测定(如间接法ELISA)需用稀的血清，可在试管中按划定的稀释度稀释后再加样。

1. 包被抗原的选择包被抗原可分为天然蛋白、重组蛋白和小分子抗原三大类。天然蛋白需经纯化才能用直接吸附法包被，对于含杂质较多的抗原可以采用间接捕获法包被（先用能够与目的抗原反应的物质如抗体直接吸附在酶标板上，再通过特异性反应使抗原固相化）。经纯化的重组蛋白一般皆可直接包板。小分子抗原比如多肽以及一些小分子有机化合物，由于分子量太小，往往难于直接吸附在酶标板上，一般都先使其与无关蛋白质如BSA等偶联，偶联物吸附于固相载体上。

2.包被液的选择一般常用的是pH9.6的碳酸盐缓冲液，如果包被的抗原在碱性条件下不稳定的话，也可以使用pH7.2的磷酸盐缓冲液。

3.包被温度的选择通常是4-8度条件下过夜或者37度保温2小时，我们强烈建议4-8度条件下包被，有利于蛋白活性的保持。

4.包被浓度的选择包被的最适浓度随固相载体和包被物的性质变化，一般蛋白质的包被浓度为1-5ug/ml，要明确针对特定包被抗原的最适包被浓度需要。包板后需要封闭吗？应该选择什么样的封闭体系？封闭是否必要，取决于ELISA的模式及具体的实验条件。一般说来，双抗体夹心法，只要酶标记物是高活性的，操作时洗涤彻底，不经封闭也可得到满意的结果。而在间接法测定中，封闭一般是必不可少的。常用的封闭剂有0.05%-0.5%的BSA、小鼠ELISA试剂盒10%的小牛血清、1%明胶、5%的脱脂奶粉，AbMART推荐使用5%脱脂奶粉，价廉而且封闭能力强，不过5%脱脂奶粉只适合短期内使用，不宜长期保存，所以ELISA试剂盒中较少使用。