色谱出峰异常现象诊断
液相色谱操作中经常遇到出峰异常现象，本文对两种情况进行了研究和诊断，一是所用的液相方法中偶尔会出现色谱峰太小的问题，二是在空白对照溶液中出现样品峰。
色谱峰太小
第一种情况源于一个分析片剂中药物含量的方法。在完成系统适用性测试后，以对照品溶液进样两针，接着是5个样品溶液，每个进样2次；然后是一个由2针对照品溶液和10针样品溶液组成的1个序列，重复进行，直到所有样品全部测试完。问题出现了，偶尔或是20个样品中会有1个，其峰面积比重复进样的要低几个百分点，超出了方法所允许的变化范围。当再次将样品进了两针后，则发现结果都与之前分析中峰面积较大的那针相符。造成此现象的原因是什么？该采取什么方法来解决呢？
原因和解决方法并非显而易见的，进一步的实验有助于搞清楚产生这种现象的几种可能。
针堵塞
有些样品瓶的瓶垫很容易被进样针穿透，是否是样品瓶垫的碎片将针堵塞了呢？目前使用比较多的瓶垫是垫的底部为PTFE（聚四氟乙烯）膜，顶部为聚合物膜。如果瓶垫被针切割下来一小片，则可能会滑落到针孔里，造成堵塞。如果将瓶垫换成中间有裂口的，或只涂有PTFE膜的瓶垫可能会使这种情况得到改善。有时进样针的损坏也会使针尖变得粗糙或者很锋利，因此，进样针不是穿透瓶垫而是如切割一般时，可以采用更换新的进样针来消除。
样品中颗粒性的物质也会产生与瓶垫碎片堵塞进样针同样的问题。进样前每一个样品溶液都须过滤或者离心，确保没有悬浮的颗粒物存在。还有一种可能是流动相或者泵密封垫的磨损。如果推测有任何一种可能性存在的话，那么从根源上解决才是有效的办法。在自动进样器之前增加一个0.5μm的多孔在线过滤器，可以将流动相中的颗粒物滤掉，避免污染自动进样器而造成堵塞。
气泡
如果进样时气泡被吸入或者随着样品溶液被吸入进样针中，那么进样体积就会比实际的低，自然就会出现峰面积小的问题。所以需确保进样针及与其相连接的管路是否完全用流动相充满，没有气泡。对于粘度大的样品，吸取的速度过快会造成进样针中混入气泡，而导致精密度下降。大多数的自动进样器配有速度可调的进样针来吸取粘度大的样品。如果样品溶液粘度非常大，调整吸取样品溶液的速度可能会改善上述现象。
数据回顾
回顾和查看以往的数据对于确定所发生错误的频率及可能存在的形式是很有帮助的。例如，问题是不是总出现在样品溶液中，还是也会出现在对照品序列中？错误是否总是发生在序列的某一位置（例如每5个样品溶液的最后两个）？错误的数量恒定吗？或者它会由一种错误转变为另一种吗？这些错误真的是独一无二或者远远超出平均值吗？将所有结果以绘图的形式表示，来观察这些错误值对于平均值来说是否呈现所期望的高斯分布，这些样品的误差是否只是超出可接受的范围，但仍在高斯曲线之中？如果是这种情况，则说明仪器没有任何问题，而是采用的方法可能含有太多的变量。
进一步的研究
如果通过上述改变仪器参数及数据回顾，仍不能获得解决办法的话，采用减少变量的方法进行进一步的研究也许是有用的。通过增大样品溶液体积，或者将样品提取液合并到一个小瓶中，这样可以去掉样品-样品之间的变量。采用同一样品瓶溶液多次进样的序列，例如，在过夜的情况下连续50次进样，这样的序列有问题吗？如果有，是否存在一种模式或者频率能够用来跟踪产生问题的根源？同样可以用对照品溶液来进行上述试验，来观察问题的出现与样品溶液有关还是与对照品溶液有关。如果两种溶液均有问题出现，那么问题一定在于仪器。如果问题只在一种溶液中出现，那么可以确定问题的产生与溶液的种类有关。
自动进样器性能检测
在进行自动进样器性能的检测时，采用色谱行为很好的样品非常有帮助。例如，采用2μg/ml的蒽的溶液，以C18柱运行样品，设定流速为1~2ml/min，检测波长254nm，10μl进样，流动相为甲醇:水80:20（v/v）（流动相选择应使保留因子k在4~5之间，对于150mm×4.6mm的色谱柱，保留时间在4~9min）。在这种色谱条件下，进样量为10μl。其相对偏差应该符合自动进样器的规定，希望最大RSD为 1%。在此条件下，很多自动进样器的RSD在0.3%~0.5%。如果上述操作是定期系统检查的一部分的话，比较一下以往的结果。如果在此条件下系统的性能不是非常好，那么在样品测试时不可能出现更好的表现。以上讨论可以发现错误的类型及产生的原因，一旦这些被发现，应采取校正来解决问题，定期的系统和维护可以避免将来这些问题的发生。
多余的色谱峰
第二个问题依然源于测定片剂中药物含量的方法，该方法在测定药物含量时显示非常好，但在测定片剂空白（除了药物主成分以外的所有成分）时出现了问题，在主峰的保留时间处出现了一个很小的色谱峰。该片剂每一种辅料单独进样，发现只有在分析聚合物辅料的时候才会出现上述小色谱峰。是什么导致这种现象产生的？该怎样消除？如果无法消除，是否能在计算药物浓度时将该峰峰面积从背景空白中减掉？
在我看来，以下两者之一的可能性会存在。一是聚合物辅料可能被药物污染或者含有另外一种物质，会和药物一起被洗脱下来。另外，由于聚合物的存在使药物释放在系统中，导致在聚合物进样时出现药物的色谱峰，该如何解决这一问题？
被污染的赋型剂
第一种情形是最容易被检测的。如果可以的话，换一台装有新的色谱柱，新配制的流动相，并且没有进行过上述分析的液相色谱系统；如果没有办法找到第二台液相的话，彻底清洗整个系统，更换掉流动相储液瓶，更换新的色谱柱。重复进样聚合物溶液，观察是否有干扰峰的出现。如果仍有色谱峰产生，它一定源于聚合物辅料本身。如果该色谱峰没有出现，则聚合物没有被污染，接下来应采取第二个行动。如果出现干扰峰，重新用新的批次制备聚合物样品溶液，注意所有使用的玻璃容器、pH计以及所有在药物主成分样品制备时使用的装置应非常洁净，确保没有污染产生。如果新的聚合物样品结果非常好，那么旧的被污染的样品则不能使用了。如果干扰峰始终存在，必须搞清楚该峰是否的确是药物主成分的色谱峰或者是其他化合物与主成分共同洗脱下来的。这时就需要采用另外的分析方法，在不同的色谱条件下运行样品溶液（例如不同的色谱柱，不同的流动相，或者不同的分析技术）。如果可以使用LC-MS，可以比较一下药物样品中的色谱峰与干扰峰是否为同一化合物。如果干扰峰是另外的化合物，从质控的角度该化合物应被视为不纯物对待，在分析时应从药物的主峰峰面积中减掉。如果药物成分色谱峰总是在聚合物中出现（极少有的情形），那么必须找到不含药物成分的聚合物赋型剂。
药物成分结合在系统中
如果聚合物赋型剂显示没有药物残留了，很有可能是聚合物在液相系统中被药物结合。其结合的位置一定是在从样品瓶到色谱柱前端这段过程，如果药物是在色谱柱里面被结合或者释放的话，则其保留时间一定与运行的药物样品溶液本身不同。由于仪器部件在非良好洗脱情形下对药物的吸附而导致单纯的残留是不太可能的，因为如果这样，当没有聚合物的空白样品运行的时候，也应该出现干扰峰。检查自动进样器的冲洗过程，改变洗脱溶剂使得药物的溶解度得以提高，例如改变pH值或有机溶剂。如果问题仍然存在，仪器内部的一些更换则很有必要。例如，可以从更换定量环和其他材质的连接管路开始，不锈钢管可以用PEEK管（聚醚醚酮）或钛材质的管路取代。如果这样做仍不能解决问题，则可以更换其他材质阀的转子。很多进样器制造商可以提供多种选择的转子密封垫。另外，在线过滤器和保护柱也会导致上述残留问题的产生，所以将这些可能产生问题的部件暂时拿掉，看看是否有不同的结果。希望这些改变可以找到问题的根源，并消除它。
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