细胞冻存实验
实验方法原理 在不附加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内外环境中的水会结成冰晶，能导致细胞发生一系列变化，如机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH 改变、蛋白质变性等等，最终导致细胞死亡。
但如向细胞培养液中加入保护剂甘油或二甲基亚砜（DMSO），可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，可避免上述现象的发生。
冻存在－135 ℃以下低温中，能减少冰晶的形成。而融化细胞时速度则要快，使之迅速通过最易受损的－5~0 ℃以后，细胞活力不受损害，仍能生长增殖。当前最常用的保护剂仍为甘油和DMSO，它们对细胞无毒、分子量小、溶解度大、易穿透细胞，使用范围在5%~15 %之间，常用10 %。
实验材料 细胞
试剂、试剂盒 胰蛋白酶BSSDMSO
仪器、耗材 吸管离心管玻璃安瓿酒精灯线绳纱布口袋搪瓷罐
实验步骤
一、冻存
1. 细胞
选项对数生长期细胞；收集细胞24 小时前换液一次；
2. 计数
按常规法把细胞制成细胞悬液，计数、令细胞密度达5×106 /ml （如一瓶细胞数量不足则用两瓶或更多的细胞），离心去上清， 吸入离心管中；
3. 冻存液
先用培养液9 分+DMSO 1 分（或甘油）配成10%的DMSO冻存液；按上法一滴滴加入离心管中，然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬；
4. 分装
分装入无菌安瓿中，每安瓿加1.5 毫升细胞悬液；
5. 封口
用塑料安瓿时拧紧瓶口即可；如用火焰封闭安瓿口后，仔细检查，定要封严，必要时可浸入蓝色液中观察，为安全起见，把安瓿缝入纱布小袋中，以防液氮浸入后，融解时因受热发生爆炸伤人；纱袋一端系以线绳，末端扎有小牌，注明：细胞名称，冻存日期，以便日后查找；
6. 冻存
当前已有专用细胞冻存器；在无冻存器的情况下，可用手工办法；从把冻存物悬在液氮罐口开始算起，按－1 ℃分钟速度，在30~40 分钟内，下降到液氮面，再停30 分钟后，直投入液氮中。
二、复苏
1. 从液氮罐中取出安瓿；有时因安瓿未封严，浸入了液氮，取出后因安瓿内液氮迅速气化而发生爆炸（力量有限），因此应带防护眼镜和手套；
2. 迅速放入盛有36 ℃~37 ℃水的搪瓷罐中，扣上盖并不时摇动，尽快解冻；
3. 剪开纱布口袋，取出安瓿，用70%酒精擦拭消毒后，净化台上打开盖（如为玻璃安瓿则折断安瓿颈部；用吸管吸出细胞悬液，装入离心管中，再补加10 ml 培养液，吹打使细胞悬浮）；
4. 低速离心（500~1000 转/分）5 分钟，取上清后再重复用培养液漂洗、离心；
5. 加入培养液适当稀释后，再移装入培养瓶中，置温箱培养，次日更换一次培养液后再继续培养。
注意事项
1. 操作时应带保护眼镜和手套，以免液氮伤人。
2. 细胞注入安瓿中后一定封严；最好使用塑料制螺口安瓿，但一定要拧紧螺帽。
3. 安瓿内冻存细胞数量要充分，在融解后能允许做1：10 倍或1：20 倍的稀释（细胞数/毫升）；
4. 一般每瓶细胞接种浓度为5×105 /ml，因此冻存密度应达到107 /ml，在稀释20 倍时，仍能保持5×105 /ml 数量。
其他
一、要点
1. 为保持细胞最大存活率，一般都采用慢冻存融的方法。
2. 冻存物距液氮面越近温度越低。标准的低冻速度为－1℃~12℃/分钟，当温度下降达－25℃时，下降速度可增至－5~－10℃/分钟，到－100℃时则可迅速冻入液氮中。因此要适当掌握冻存物下降入液氮中的速度，过快能影响细胞内水分透出，太慢则促冰晶形成。
