动物细胞线粒体可溶性总蛋白制备试剂盒产品说明书（中文版）

　　主要用途

　　动物细胞线粒体可溶性总蛋白制备试剂是一种旨在从动物细胞中分离出完整而纯化的线粒体细胞器，并在蛋白酶抑制混合剂的帮助下，使已纯化的线粒体膜结构破裂而获得线粒体内活性蛋白酶系统的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物细胞（动物和人体的原代细胞、培养细胞等）中线粒体总蛋白的制备。可以被用于细胞凋亡、信号传递、古生物、衰老、代谢和营养学等的研究。可直接用于特定蛋白后续纯化、蛋白一维或二维电泳、西方杂交、免疫抗体和质谱分析等等。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

　　技术背景

　　线粒体是细胞中重要的细胞器，其主要功能是提供细胞内各种物质代谢所需要的能量。线粒体中含有丰富的细胞色素氧化酶系统和细胞凋亡相关蛋白等。通过机械或化学方法破裂细胞，进而差速离心获得线粒体，然后通过特殊裂解液和蛋白酶抑制混合剂防止裂解后线粒体内各种活性蛋白成分遭到活化的内源性蛋白酶的破坏，充分保留线粒体内蛋白质的免疫和生物学活性，最后进行相关蛋白的独立分析。

　　产品内容

　　清理液（Reagent A） 100毫升

　　裂解液（Reagent B） 80毫升

　　净化液（Reagent C） 20毫升

　　强化液（Reagent D） 10毫升

　　保存液（Reagent E） 160毫升

　　破膜液（Reagent F） 2毫升

　　活性液（Reagent G） 20微升

　　上样液（Reagent H） 3毫升

　　产品说明书 1份

　　保存方式

　　保存净化液（Reagent C）和活性液（Reagent G）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月

　　用户自备

　　HANK平衡盐缓冲溶液（12028）或PBS缓冲溶液（12033）：用于清理细胞

　　胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于细胞脱离

　　完全细胞培养液（12052）：用于细胞处理所需的培养基

　　15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

　　50毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

　　1.5毫升离心管：用于样品操作和保存的容器

　　4℃台式离心机：用于样品操作

　　微型4℃台式离心机：用于样品操作

　　DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞

　　涡旋震荡仪：用于混匀

　　实验步骤

　　方法一：物理法

　　实验开始前，将试剂盒里的净化液（Reagent C）冻融，然后移出1毫升净化液（Reagent C）和4毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，放进冰槽里备用。然后进行下列操作。

　　准备5至10瓶75cm2细胞培养瓶的细胞（5 X 107），直至细胞生长铺满整个培养表面

　　分别加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面

　　分别小心抽去缓冲溶液

　　重复实验步骤2至3一次

　　分别加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个细胞生长表面

　　放进37℃培养箱3分种

　　轻轻手击震动培养瓶，使细胞脱落

　　分别加入10毫升用户自备的完全细胞培养液

　　移入一个50毫升锥形离心管

　　放进台式离心机离心10分钟，速度为200g

　　小心抽去上清液

　　加入5毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀细胞

　　放进台式离心机离心10分钟，速度为300g

　　小心抽去上清液

　　加入5毫升预冷的裂解工作液

　　涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群

　　即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器

　　在冰槽里用匀浆棒匀化细胞（约80下）（注意：参见注意事项8）

　　将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管

　　放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g

　　小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞

　　放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g

　　小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物

　　（选择步骤）加入3毫升预冷的保存液（Reagent E）

　　（选择步骤）放进4℃台式离心机再次离心5分钟，速度为10000g

　　（选择步骤）小心抽去上清液

　　加入100微升破膜液（Reagent F）到线粒体颗粒样品中

　　加入1微升活性液（Reagent G）

　　涡旋震荡15秒

　　放进冰槽中孵育15分钟

　　涡旋震荡60秒

　　放进微型台式离心机离心2分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

　　小心移取上清液到新的1.5毫升离心管――此为所有可溶性线粒体蛋白系统

　　若暂时不予后续处理，保存在－20℃冰箱里

　　继续进行下列操作：

　　操作一、线粒体总蛋白定量检测

　　1） 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

　　操作二、可溶性线粒体蛋白电泳

　　1） 移取20微升（1微克/微升）上清液到新的1.5毫升离心管

　　2） 加入20微升上样液（Reagent H）

　　涡旋震荡15秒

　　放进微型台式离心机离心10秒，速度为500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

　　煮沸5分钟

　　上样，进行电泳操作和西方杂交

　　方法二：化学法

　　实验开始前，将－20℃冰箱里的净化液（Reagent C）取出冻融，然后移出1毫升净化液（Reagent C）和4毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，放进冰槽里备用。然后进行下列操作。

　　准备5至10瓶75cm2细胞培养瓶的细胞（5 X 107），直至细胞生长铺满整个培养表面

　　分别加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面

　　分别小心抽去缓冲溶液

　　重复实验步骤2至3一次

　　分别加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个细胞生长表面

　　放进37℃培养箱3分种

　　轻轻手击震动培养瓶，使细胞脱落

　　分别加入10毫升用户自备的完全细胞培养液

　　移入一个50毫升锥形离心管

　　放进台式离心机离心10分钟，速度为200g

　　小心抽去上清液

　　加入5毫升预冷的清理液（Reagent A）

　　放进台式离心机离心10分钟，速度为300g

　　小心抽去上清液

　　加入5毫升预冷的裂解工作液

　　涡旋震荡5秒，充分混匀

　　在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次

　　加入500微升预冷的强化液（Reagent D）

　　涡旋震荡5秒，充分混匀

　　在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项9）

　　加入5毫升预冷的保存液（Reagent E），轻轻摇动试管混匀

　　放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g

　　小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞

　　放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g

　　小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物

　　（选择步骤）加入3毫升预冷的保存液（Reagent E）

　　（选择步骤）放进4℃台式离心机再次离心5分钟，速度为10000g

　　（选择步骤）小心抽去上清液

　　加入100微升破膜液（Reagent F）到线粒体颗粒样品中

　　加入1微升活性液（Reagent G）

　　涡旋震荡15秒

　　放进冰槽中孵育15分钟

　　涡旋震荡60秒

　　放进微型台式离心机离心2分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

　　小心移取上清液到新的1.5毫升离心管――此为所有可溶性线粒体蛋白系统

　　若暂时不予后续处理，保存在－20℃冰箱里

　　继续进行下列操作：

　　操作一、线粒体总蛋白定量检测

　　1） 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

　　操作二、可溶性线粒体蛋白电泳

　　1） 移取20微升（1微克/微升）上清液到新的1.5毫升离心管

　　2） 加入20微升上样液（Reagent H）

　　3） 涡旋震荡15秒

　　4）放进微型台式离心机离心10秒，速度为500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

　　5）煮沸5分钟

　　6）上样，进行电泳操作和西方杂交

　　注意事项

　　本产品为20次（5 X 107细胞）操作

　　实际操作的细胞量与试剂用量成比例调整

　　操作时须戴手套

　　整个操作过程须在4℃条件下进行

　　使用时，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent E）

　　建议使用足够的样品量；建议使用5 X 107细胞

　　建议严格控制操作时间

　　通常匀化次数为80下达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同的组织类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加匀化次数。

　　通常孵育5分钟达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同的组织类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升裂解物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加孵育时间和涡旋震荡次数

　　对于难以裂解的细胞，例如HeLa细胞，采用物理匀浆法是优先推荐的技术处理

　　通常5 X 107细胞的线粒体含量为50微克线粒体蛋白

　　12． 本产品所获得的线粒体纯度和产量最为理想。通过调整10000g离心速度到3000至8000g，可以提高粗提的线粒体纯化程度，但线粒体产量相应减少

　　如果需检测不可溶性线粒体蛋白，可保留线粒体裂解后的沉淀物，直接加入10微升上样液（Reagent H）和10微升无离子水，然后继续操作二的步骤3至6

　　线粒体蛋白须放在－70℃冰箱里储存备用，避免反复冻融

　　本公司提供系列线粒体分析试剂产品

　　质量标准

　　本产品经鉴定性能稳定

　　本产品经鉴定无蛋白酶污染

　　本产品经鉴定蛋白萃取产量高

　　本产品经鉴定纯化程度高