一、目的基因的获得

目的基因是指所要研究或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因。获得目的基因是分子克隆过程中最重要的一步。目前用于获得目的基因的方法有几种，如限制性内切酶直接分离法、文库筛选法、体外扩增法和人工合成法等，其中限制性内切酶法直接分离目的基因和多聚酶链式反应（PCR）或逆转录-多聚酶链式反应（RT-PCR）体外扩增目的DNA片段是目前最常用的方法。

（一）采用限制性酶切法直接分离目的基因

1. 从原核基因组中制备　原核基因组相对较小，用几种限制性内切酶分别消化原核基因组，或用某种限制性内切酶对所要研究的基因组进行部分消化，可以得到大小不等的各种片段，其中有些片段就会含有目的基因，将这些片段插入载体中进行克隆，经过筛选，可以得到所需的目的基因。

2. 从真核基因组中制备　真核基因组比较大，直接用限制性内切酶消化后需要筛选的克隆数太多，不易操作。可以用一种限制性内切酶先消化基因组DNA，产生连续的DNA片段，然后电泳分离这些DNA片段，再用一段特异探针与这些DNA片段进行杂交，在含有特异性模板的区域就会出现杂交带，可以初步鉴定基因组中是否含有目的基因。我们也可以将酶切后的基因组DNA片段全部克隆入适当的载体中，制成基因组文库，再用特异性探针与基因组文库中的不同克隆进行杂交，阳性克隆即表示克隆到的DNA片段含有特异基因序列。将阳性克隆测序，用第一个克隆片段的末端分离下一个克隆片段，然后利用DNA片段间的重叠顺序来鉴定其他克隆。这样一步步走下去，最终可得全部基因序列，这种技术叫做染色体步移（chromosome walking）。

（二）采用PCR或RT-PCR方法制备目的基因

根据已发表的基因序列设计并合成引物，采用PCR（以基因组DNA为模板）或RT-PCR（以mRNA为模板）从组织或细胞中获取目的基因片段用于基因操作，这是实验室中最常用的获取已知基因的方法。

利用PCR获取目的基因的一大优点就是可以根据需要在引物序列上设计适当的酶切位点、起始密码子或终止密码子等，或通过人为错配改变碱基序列（人工突变）对目的基因进行有限修饰。对于未知基因，可采取构建RT-PCR文库的方法获得未知基因：利用mRNA末端poly A序列尾设计共用引物，将所有mRNA逆转录成cDNA，利用各种工具酶在cDNA末端加尾，然后采用一对共用引物扩增所有cDNA片段，将经PCR扩增后的片段插入到适当载体中，构建成PCR-cDNA文库。这种方法的优点是可以将表达水平很低的mRNA扩增出来，有利于筛选出表达丰度低的基因。由于经过PCR扩增，基因序列的精确性需要采用其他方法进一步确定。

还有一个获得目的基因的方法是利用计算机技术进行“计算机克隆”，即利用GenBank中的基因信息，通过软件比较不同种属基因之间的相似性（同源性），利用保守区序列设计引物，再用PCR或RT-PCR从不同种属或不同组织细胞中获取未知的基因片段。这是目前可实现的一种获得新基因的捷径。

（三）基因组文库或cDNA文库的构建和筛选

将基因组DNA用限制性内切酶消化后插入到适当载体中，得到含有不同插入片段的克隆载体，这种克隆载体的混合物含有长短不同的基因组片段，这就是基因文库。若将细胞内所有mRNA均逆转录成cDNA，然后将所有cDNA片段克隆到适当的载体中，构建成含有不同cDNA片段的克隆载体混合物，这就是cDNA文库。目前许多组织或细胞的基因组或cDNA文库都可以从商业公司买到。

当获得了基因组文库或cDNA文库，可以根据已知的信息合成特异性探针，采用核酸分子杂交的方法从文库中筛选感兴趣的基因片段，这仍是目前获得新基因的一种常用手段。基因组文库或cDNA文库的构建和使用请参见本书相应的章节。

（四）化学合成法制备基因片段

采用DNA合成仪，对目的基因进行分段合成，然后进行连接，可以得到所需的目的基因。化学合成法可以改变原始的基因序列，甚至可以合成自然界不存在的序列。在合成过程中可以根据需要改变核苷酸的密码子，如将真核基因序列中不易在E. coli中利用的稀有密码子改成E. coli偏爱的密码子，有利于真核基因在E. coli中的表达。