免疫印迹法的原理和基本步骤

免疫印迹法分三个阶段进行.

第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE):抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷,在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动,分子量越小,泳动速度就越快.此阶段分离效果肉眼不可见(只有在染色后才显出电泳区带).

第二阶段为电转移:将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上,选用低电压(100V)和大电流(1～2A),通电45min转移即可完成.此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见.

第三阶段为酶免疫定位:将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后,加入能形成不溶性显色物的酶反应底物,使区带染色.

常用的HRP底物为3,3'-二氨基联苯胺(呈棕色)和4-氯-1-萘酚(呈蓝紫色).阳性反应的条带清晰可辨,并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准,确定各组分的分子量.

本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性,是一个有效的分析手段,不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性,并可用于疾病的诊断.

在艾滋病病毒感染中此法作为确诊试验.抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后,将膜切成小条,配合酶标抗体及显色底物制成的试剂盒,可方便地在实验室中供检测用.根据出现显色线条的位置可判断有无针对病毒的特异性抗体.