pcr的技术的主要步骤及pcr引物设计的一般原则
PCR的技术的主要步骤及PCR引物设计的一般原则分述如下:
PCR的技术的主要步骤:
1、DNA变性:(90℃-96℃):双链DNA模板在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA。
2、退火:(60℃-65℃):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。
3、延伸:(70℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右,活性最佳)的作用下,以dNTP为原料,从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸,合成与模板互补的DNA链。
每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量即增加一倍。现在有些PCR因为扩增区很短,即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成,因此可以改为两步法,即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行,以减少一次升降温过程,提高了反应速度。
2、引物设计的基本原则
1、引物长度:15-30bp,常用为20bp左右。
2、引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。
3、引物内部不应出现互补序列。
4、两个引物之间不应存在互补序列,尤其是避免3 ′端的互补重叠。
5、引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%,引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列,否则易导致非特异性扩增。
6、引物3‘端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,最佳选择是G和C。
7、引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点,引入突变位点,用生物素、荧光物质、地高辛标记,加入其它短序列,包括起始密码子、终止密码子等。