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分析测试百科网 > 行业资讯 > 技术原理

蛋白质糖基化的检测实验——化学脱糖基化

2019.4.05
实验材料

蛋白样品

试剂、试剂盒

TFMS苯甲醚

仪器、耗材

玻璃器皿

实验步骤

1. 在冰上预冷干净、干燥的玻璃器皿。用带有 Teflon-丝帽的玻璃试管混合试剂。

2. 打开或混合试剂前，在冰上预冷所有的溶液。从冰冷的原液中，TFMS:苯甲醚 ( Sigma) 以 2:1 (v/v) 的比例混合。缓慢的向试管内（放在冰上）注入一股氮气 10 秒钟，盖住试管倒转几次，然后用氮气重复处理。保持溶液在冰上。

3. 用冻干或真空离心法制备充分干燥的糖蛋白样品。

4. 当样品已干燥，盖上样品试管并用封口膜封住盖子周围，在冰上充分冷却。

5. 在干燥、冰冷的蛋白样品中，加 200 μl 冷的 TFMS:苯甲醚，并完全溶解。

6. 在样品试管冰浴的同时，用缓慢的一股氮气快速排气。迅速盖上试管盖，用封口膜再次密封。

7. 样品保存在冰上 2 小时，然后在 -20℃ 中再保存 2 小时。

8. 放样品于冰上，加 10 μl 冰冷的 2 mol/L Tris 碱，然后加 300 μl 冰冷的含 10 mmol/L DOC 的 50% TCA。将样品在冰上放置 20 分钟。

9. 微型离心机以最大速度（16000 g）4℃ 离心 15 分钟使蛋白沉淀。用冰冷丙酮清洗沉淀两次，以辅助去除残留的苯甲醚。

10. 用真空离心干燥最终沉淀物，悬浮于合适的样本缓冲液中以备 SDS-PAGE 分析。

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