这一部分着重讨论一些对成功记录光学十分重要的方法学问题或实验技术，但不介绍单一的方法，因为实验中进行光学记录的方法实际上是各种各样的，也就是说，这里只考虑所有实验中都常见的因素。在这些因素中很多是很普通的，但它们经常是实验成功和不必要的失败之间的差别之所在。这些因素包括： 一光指示剂的配制与储存 —负载和染色方案 一实验设计 一校准步骤 —信号处理方法 一、光指示剂的配制与储存1.VSD 的溶解和储存溶解和储存这些指示剂没有一个统一的方法，大多数情况下，各种染料配制的最佳条件都是经验性的。因为双嗜性分子的特性，大部分 VSD 并非天然水溶性』有时需要表面活性剂去溶解它们。同时，有时也需要用其他试剂帮助这些染料渗入细胞膜内，这样的试剂包括各种溶剂或其混合剂，以及表面活性剂，如：乙醇（EtOH)、甲醇 (MeOH)、二甲亚砜（DMSO)、二甲基甲酰胺（DMF)、聚醚（Pluronic)F-127、胆盐 (如胆酸钠)、染色小泡。 常用于单细胞研究的 VSD 的溶解和储存方法例示如下：
 2.CaSD 的溶解和储存离子敏感性指示剂一般分为两类：游离盐类和乙酸甲基（AM) 酯类。这两类 CaSD 在溶解与储存上是各不相同的。游离盐类：大部分 CaSD 游离盐是水溶性的，而且无论是溶解状态还是固体状态都可在-20T：下长期稳定保存。通常这些盐类用于微量注射或透析，故可用纯水（无钙）配制浓缩的储存液。制备这些溶液没有什么特殊要求，不过，将其制备成浓缩母液（50?IOOX) 分装保存更好些。这些分装的母液应在干燥、-20X：保存。 注意：有些研究者将这些染料和膜片钳电极内液混合后冷冻储存，不过我们的经验提示，用这种方法储存的染料会降解得更快些。
二、负载/染色方案光指示剂的负载/染色有多种可能的方法，这些方法分为两类：成批负载和单细胞负载。 在成批负载研究中，所有存在的细胞都被负载，或者说是无差异染色。成批负载的方法包括： —浴槽孵育 一 AM 酯负载 一电穿孔 —阳离子脂质体转导 —低渗振荡 最常用的介导钙染色剂进入细胞内的方法是利用 AM 酯。AM 酯屏蔽染料分子的强负电荷部分（表 4-2)，所以能滞留于细胞膜上。AM 酯一旦进入细胞，非特异性酯酶将钙敏感性染料上的酯类清除掉，而染料就在细胞内了。在单细胞研究中通常通过微量注射法或膜片钳电极透析法进行负载，也可用局部电穿孔的方法。 下面介绍的是光学记录中最常用的三种方法：①孵育法；②微注射法；③透析法 (通过膜片钳电极)。 在每一具体情况下，最佳的染色/负载条件依赖于所使用的指示剂而定。通常最佳条件的确定都是经验性的，但如下列举的几个代表性例子可以作为指导。
 三、实验设计利用光学指示剂进行实验的设计和实施，需要认真考虑诸多因素，其中有些因素是获得有用的数据和避免伪迹性结果的先决条件。这些因素的考虑可分为两类，即对所有实验都适用的一般因素，以及专门对光学指示剂的实验适用的因素。 1.一般设计应考虑的方面要对实验操作或用药产生作用进行可靠性判断，需要满足几个基本的标准： 一测量的基线：实验操作或应用药物之前是否有稳定的基线？ 一重复性：所观察到的实验结果是否可以重复？ 一可逆性：在撤销实验操作或药物后实验作用能否恢复如初？ 一等级反应：反应是否随刺激强度的改变而呈等级性变化？ —药理学特征：反应能否被相应的药物阻断或增强？ 2.特殊设计应考虑的方面特殊用于光学指示剂的实验设计，通常要考虑：染料的使用、信号的优化，以及附加电生理技术的结合。 染料的选用：需要建立特殊标准以判断染料的浓度和 (或) 灵敏度在整个实验中是否稳定。染料浓度和灵敏度的非均一问题，可以由膜片钳电极的不完全透析或电压敏感性染料的内化所致。通常用标准或对照刺激引起的反应来确认反应性的稳定。 信号的优化：有时，总体信号中含有特异和非特异信号，因此要想方设法区分这些成分。非特异性荧光的一个例子是由细胞产生自身荧光。这种内在发射的焚光不依赖于其他外在荧光分子，在用靠近紫外光波的光源照射生物样品时，自身荧光就成了一个问题。解决这个问题的方法是：先测量没有光学指示剂时细胞的荧光，再在有染料存在的静息荧光值减去该值。这个值一般在染色之前测量，或在实验中染料未染色的相同区域测量。另外一个重要的实验问题在于是否需要平均信号或进行数字化过度采样，以检测到我们想观测的信号。在信号较小并需要平均的情况下，必须采集足够同样的记录以进行平均处理。最后，如果光源强度大，应当考虑是否需要漂白校正，漂白校正通常是进行对照记录，对照记录是在实验条件下，没有进行刺激或实验操作过程中采集的。 综合：光学记录与电生理技术的结合，往往需要特定的程序改变。例如，溶于溶剂尤其是 DMSO/F-127 中 VSD，会阻抑膜片钳电极与细胞膜的封接，所以有时在细胞染色前就形成这种封接是必要的。 四、校准的方法如果实验的目的是需要一个定量的结果或测量所需参数绝对的变化值，那么就必须进行光学信号校准<；同样，如果要求在不同的实验中进行信号的比较，或在同一实验中比较不同点的信号，这些信号都要进行校准。如果用定量法记录所有的信号，就展示出它的优点了，不过因为其他原因这种方法并非一定能用上，如经常涉及的记录带宽等。 光学信号的校准常从以下方法中选用：单一波长测定法、比值测定法、混合测定法。 毋庸置疑，比值测定法可得到最可靠的结果。此法可在对激发光或发射光具有光谱偏移的一些指示剂使用，这依赖于所需观察的变量。这些光谱偏移允许对荧光强度变化方向相反的两种波长进行比较，或单一波长与光谱 isosbestic 点（即对所测参数不敏感点）的比较。除了能提供定量的结果外，比值测定法还可降低或排除由以下原因引起的荧光系统性误差：指示剂浓度；激发光路长；激发光强度；探测器效能。 更为重要的是，比值测定法还能排除许多伪迹和非系统性因素，包括：光漂白；指示剂超时漏出；指示剂分布不均；不同的细胞厚度。 在有些情况下，比值测定法也更加敏感，因为每一波长的荧光变化通常都是反向变化的信号，故信号比值的变化比任一单波长的变化更大。 不过在一些实验条件下，应用比值测定法是不合实际的，这就可以应用混合测定法 (Lev-Rametal.1992)。混合测定法就是在不同的瞬时，将定量测定与定性估测相结合，例如，初始基线可用比值测定法进行定量测定。随后，可以用高得多的测量频率, 对单波长相同参数的快速变化进行定性的测量。不过，要重点注意的是，这种方法假设在单波长测量法记录过程中，所有其他的变量（尤其是指示剂浓度）都是保持不变的。 比值测定法与非比值测定法都已用于钙敏感性染料和电压敏感性染料。每一类型的校准方法将在下文举例论述。表 4-6 用图示法概括了各种情况下如何进行的测量。此外，将两类指示剂都常用的一般指导原则也概述如下： 1.VSD 校准电压敏感性荧光染料通常被称为「无刻度线性电压表」。不过它们只能提供电压改变的信息，而电信号的绝对振幅则因染料染色的不同和局部敏感性的变异而不同。因此，这些染料最常用于点之间的非校准的绝对比较，样本间的比较是不可行的。然而，校准的测量在某些情况下也是可能的，其测量是否成功，很容易通过同步电测量进行验证。此类型的测量包括下述检测：单波长法；基于一个激发光谱偏移的双激发光波长法；基于一个发射光谱偏移的双发射光波长法。
<img alt=”的校准方法（ Zhang etal. 1998)。这种激发比值构成法的弊端，在于需要交替两个图 像和/或转换激发光谑光片，这不仅费时而且限制了总体时间带宽，不能满足获取快速 事件如动作电位的要求9 标准化的比值数据转换为绝对膜电位值（ mV) 的公式为 V m = C F X R ‘ 式中， CF指比值数据与膜电位值之间的转换因子； J?’指标准化的比值（ 通常标准化到 • R为 OmV)。 3 . 用在基于一个发射光谱偏移的双发射光波长的、可检测膜电位绝对变化的比值 测 定 法 （BullenandSaggau 1999; BeachetaL 1996):这是用指TTC 剂测量膜电位变化 的又一种比值测量法，即使用单激发光波长的同时测量双发射光波长，此法依赖于电压 敏感染料di-8-ANEPPS的发射光谱呈现的电压依赖性光谱偏移。通常，使用后继双向 光束分光仪（ 如 DCLP5 7 0 ) 或三棱镜和双光电探测器（ 2.CaSD 的校准此类指示剤有三种可能的校准方法，它们分别是：单波长法；基于一种激发光偏移或一种发射光偏移的比值法；混合法。
 3.用于光指示剂校准的一般指导原则将光学测量值转换成所观察生理参数的重要一步，就是实验后校准。尽管在溶液或各种简化的标本（如小泡）中，可测到用于电压和钙离子指示剂校准的转换因子，但这些条件一般并不符合细胞内环境的真实值。在这些情况下不能很好重复的因素有：温度、pH、离子浓度、染料与蛋白质或膜的交互作用。 而且，一些 CaSD 和细胞内蛋白质的相互作用也被发现能改变表观 2^〇^^-bayashietal.1993)。简言之，原位校准要优于等效的离体过程，因此要尽可能采用前法。 这些校准法通常可用破孔离子载体的细胞化学钳方式完成_^例如，膜电位比值可用缬氨霉素校准，即特异地将一系列缬氨霉素介导的 K+扩散电位，用于建立欲测膜电位范围的梯度，并同时测定荧光比值。此过程的细节请参阅 Loew(1994)。同样的，钙离子比值测定法也可用离子载体如伊屋诺霉素或卡西霉素（或其类似物 4-brom 〇-A23187) 进行原位校准? 但是，用这些化合物时应注意，它们具有相当强的自身荧光，特别在紫外光下更明显。这些方法的细节描述请参阅 Kao 所写的相关章节（Nucdtelli1994)。 本章也会讨论一些校准过程中的一般设想与实际的局限性。 注意：一般在计算比值或 AF/F 前先要减去任何自身荧光值或其他偏差。
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