cDNA文库构建技术-cDNA链的反转合成
实验概要
构建cDNA文库是一种获得目标基因并进一步进行基因重组，基因克隆的重要方法，而在该文库构建中有mRNA 逆转录出cDNA是一步极为关键的操作。mRNA的逆转录主要由MMLV、AMV两种逆转录酶催化合成cDNA，在这个逆转录过程中，模板mRAN及逆转录酶是两个最重要的影响因素。对于mRNA来讲，一是丰度，二是纯度，丰度愈高，纯度越好，合成效率越好。在逆转录酶作用下，以Oligo(dT)或寡聚６核苷酸(随机)为引物，进行cDNA第一链的合成。而第二链的合成有自身引物合成，外加引物合成及置换合成，本实验采用置换合成法进行，即在RNaseH作用下，部分降解RNA，再用DNA多聚酶Ⅰ产生的DNA片段取代，以合成第二条链。
实验原理
主要试剂
cDNA合成试剂盒、饱和酚、氯仿/异丙醇、EDTA、乙醇、3M NaAC pH 5.2、TE缓冲液
主要设备
恒温水浴，离心机、电泳仪、电泳槽、紫外观测仪
实验步骤
1. 第一链的合成：
1) 在灭菌的DEPC处理Eppondef管中，分别加入:
模板 样品mRNA 1μg
引物 (0.5μg/μl) 1μl （6碱基随机引物 或oligdt）
加水至 10μl
2) 70℃5-10分钟，冰浴冷却5分钟。
3) 在上管中，根据下表依次序分别加入
5×第一链缓冲液 4μl
核酶抑制剂 40μ
40mM焦磷酸钠 2μl
AMV反转录酶 20 μ
加水至 20μl
4) 敲打混合，离心后放于37℃或42℃60分钟。
5) 反应完毕后，将反应管置于冰浴。用于第二链合成。
注：引物可为特异引物（构建特异文库）、olig0(dt)15引物或6核苷酸随机引物，但不同引物RT时温度不同，前两种在42℃下进行，而随机引物则在37℃下进行。
2. 第二链的合成
1) 第一链合成完毕后，直接进行第二链的合成。在第一链合成体系中分别加入
2.5×第二链缓冲液 40μl，
DNA聚合酶Ⅰ 23μ
RNase H 0.8μ
加水至 100μl
2) 14-16℃下放置2小时。(>3Kb时反应时间延长至3-4小时)。
3) 70℃，10min，点动离心，置于冰浴。
4) 在样品管中加入T4DNA聚合酶2ul，37放置１0分钟。
5) 加入 4μl 500mM的EDTA到该样品管中，然后置于冰浴上。
6) 等体积加入酚\氯仿\异戊醇抽上清，12000g，3min。
7) 上清液转移至一干净试管，加2V乙醇，1/10V乙酸钠，-20℃30min沉淀，12000g，15min收集沉淀，70%乙醇洗沉淀，干燥，TE复溶。
合成后的cDNA链既可经与一定的通用接头连接后，生成末端序列，也可通过一定的内切酶处理，形成一定序列的末端片断，然后（1）与未端有互补序列的λ臂-DNA连接，形成重组λ-DNA，再经体外包装形成完整λ噬菌体，经转染后，生成噬菌体cDNA文库.（2）与未端有互补序列的质粒载体连接，形成重组质粒DNA，生成质粒cDNA文库。目前经常使用的一些载体已经商品化，商品化的λ载体主要有噬菌体左右臂、复制原点及启动序列构成，其在连接酶作用下，可直接于具相同末端序列的cDNA互补连接。cDNA末端序列的产生可通过1)可添加核苷酸后酶切；2)直接加商品接头而形成与相应噬菌体左右臂相互补的序列。不同载体有不同的末端序列，有不同的宿主菌，有不同的筛选方式，因此在进行文库包装时，一定要搞清楚这些情况，以有的放矢的进行工作。
附 件 (共1个附件,占40KB)
1.jpg
40KB
查看
