双酚A免疫亲和柱使用说明书IAC316
IAC-SEP®双酚A免疫亲和柱
使用对象
IAC-SEP®双酚A亲和柱能够特异性的纯化样品中的双酚A，它采用了柱状琼脂糖凝胶作为固相载体，琼脂糖凝胶与双酚A抗体偶联形成免疫吸附剂，装柱制成免疫亲和柱。它能够特异性的纯化样品中的双酚A。双酚A亲和柱广泛地应用于饮料、牛奶和奶粉，尿液等样品的提取，该方法速度快、操作简单、准确性高，对提高食品的质量和安全性起到十分重要的作用。
原理
双酚A免疫亲和柱能够特异性的纯化样品中的双酚A，将样品与提取液混合、提取、过滤，然后将滤液通过双酚A亲和柱。此时，双酚A物质键合在亲和柱中的抗体上。用蒸馏水将免疫亲合柱上的杂质除去。用甲醇通过分离柱，将双酚A从抗体上分离下来。最后，将过滤的甲醇溶液注入HPLC或LC-MS进行测定。
储存条件
该亲和柱保存在2-8 °C条件下，绝对不能冷冻，保质期为18个月。建议在室温（18-30°C）下使用。
实验溶液制备
pH7.4 PBS溶液：8.0 克NaCl + 2.90克Na2HPO4 12H2O + 0.24 克 KH2PO4 + 0.2克KCl 加990mL纯水溶解，加纯水至1升。
液相色谱条件
色谱柱：Cloversil-C18,4.6×250mm（5um）
流动相：甲醇:水=70:30（v/v）
流速：1.0 mL/min
检测器：荧光检测器，激发波长227nm， 发射波,313nm
进样体积：20uL
分析步骤
奶粉：称取 5 g(精确至0.01 g)试样，置于250 mL 烧杯中。将50mL 已预热到50 ℃的水加入到乳粉中，用玻璃棒将其混合均匀。如果乳粉仍未完全溶解，将烧杯置于50℃的水浴中放置30 min。溶解后冷却至20 ℃，移入100 mL 容量瓶中，用少量的水分次洗涤烧杯，洗涤液一并移入容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。准确移取吸取下层液20.0 mL，备用。
婴幼儿米粉: 称取 6 g(精确至0.01 g)试样，置于50 mL 离心管中。准确加入30.0 mL 60%乙腈水，混匀，震荡提取30min。然后4000 RPM离心10min，将上层液体用普通滤纸过滤。准确量取滤液10mL于100mL锥形瓶中，加入50mL纯水稀释混匀，备用。
饮料：准确量取样品25mL于50mL容量瓶中，调节PH值7-8左右， 用 pH7.4 PBS溶液定容至50mL，准确移取吸取下层液40.0 mL，备用。
< >牛奶,奶粉（测定范围：牛奶样品0-50μg/L，奶粉样品0-500μg/kg）
将免疫亲和柱连接于20.0mL玻璃注射器下。准确移取20.0mL样品提取液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约2mL/min（1滴/秒）流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2~3mL空气通过柱体。以2-3mL/min（1-2滴/秒）流速用10.0mL水淋洗柱子1次，弃去全部流出液，并使2mL~3mL空气通过柱体。准确加入1.0mL色谱级甲醇洗脱，流速为1 mL/min ~2mL/min（1滴/秒），收集全部洗脱液于玻璃试管中， 50 °C下氮气浓缩吹干后，用流动相定容至0.5 mL，供HPLC或LC-MS分析。
饮料（测定范围： 0-25μg/L）
将免疫亲和柱连接于50.0mL玻璃注射器下。准确移取40.0mL样品提取液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约2mL/min（1滴/秒）流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2~3mL空气通过柱体。以2-3mL/min（1-2滴/秒）流速用10.0mL水淋洗柱子1次，弃去全部流出液，并使2mL~3mL空气通过柱体。准确加入1.0mL色谱级甲醇洗脱，流速为1 mL/min ~2mL/min（1滴/秒），收集全部洗脱液于玻璃试管中， 50 °C下氮气浓缩吹干后，用流动相定容至0.5 mL，供HPLC或LC-MS分析。
婴幼儿米粉:（测定范围：0-100μg/kg）
将免疫亲和柱连接于50.0mL玻璃注射器下。准确移取全部60.0mL样品提取液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约2mL/min（1滴/秒）流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2~3mL空气通过柱体。以2-3mL/min（1-2滴/秒）流速用10.0mL水淋洗柱子1次，弃去全部流出液，并使2mL~3mL空气通过柱体。准确加入1.0mL色谱级甲醇洗脱，流速为1 mL/min ~2mL/min（1滴/秒），收集全部洗脱液于玻璃试管中， 50 °C下氮气浓缩吹干后，用流动相定容至0.5 mL，供HPLC或LC-MS分析。
注：为了节约实验时间，可以省去氮气吹干的步骤，将1.0mL色谱级甲醇洗脱液直接注入HPLC检测（前提是液相色谱仪条件允许），因此，检测灵敏度会降低2倍。
注意事项
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C/N编号
物品
21022
Clover六位泵流操作架（配有1台空气泵，6个10mL针筒）
20202
高速匀质器，转速可达18,000 r/min ~22,000 r/min
31955
美国vicam微纤维滤纸（1.5um，100张/盒）
31240
折叠式槽纹滤纸（100张/盒），或中速定性滤纸
36010
一次性塑料烧杯(25/包)
34000
一次性测试管(250支/包)
36020
塑料漏斗(10 个/包)
35016
色谱纯级的甲醇（4升/瓶）
C546150-U
Cloversil C18 反相色谱柱4.6*150mm（5um）
C546250-U
Cloversil C18 反相色谱柱4.6*250mm（5um）
