实验材料 麦穗

试剂、试剂盒 植物凝胶乙醇次氯酸钠蒸馏水亚精胺

仪器、耗材 EP 管移液枪

实验步骤

1. 组织培养基的准备

( 1 ) 首先准备所需浓度 2 倍的植物凝胶，高压灭菌（见注 2 ) 。

( 2 )  所有的组织培养基都要过滤灭菌，因此除了无菌的储备液，其他培养基成分按所需浓度 2 倍的量混匀，调到合适的 pH 后过滤灭菌（使用瓶顶过滤器、0.22 μm 微孔滤膜）。

( 3 ) 使用前将 2x 凝胶和 2x 培养基在水浴锅中加热至 60℃。

( 4 ) 将所需储备液在无菌条件下加入到热的培养基中，培养基和植物凝胶混合后倒入 9 cm 培养皿中（Sterilin)。

( 5 ) 分化培养时，使用高培养皿（100 mmx 20 mm，Falcon) 。

( 6 ) 渗透处理时，使用 5 cm 小培养皿 （Sterilin) 。

2. 幼胚的分离

(1) 幼穗的采收与消毒

① 当幼胚直径长到 1~2 mm 时米收麦穗（见注 3) 。

② 在取麦穗之前，从每一穗中间取一粒种子，查看幼胚的大小，确保达到所需的要求 [ 可参考第 9 章「农杆菌介导的大麦转化方法」，图 9.2 (a ) ~（c ) ] 。

③ 将种子从穗子上取下来，去芒，但不要破坏种壳。

④ 先用 70% 的乙醇冲洗 30s，再用蒸馏水冲洗 3 遍，然后在次氯酸钠（Fluka 71696) 与水比例为 50：50 的溶液中浸泡 4 min，再用蒸馏水冲洗 4 遍 ，最后将水倒掉但保持种子湿润，置于无菌的螺口瓶中待用。

(2) 分离幼胚摘除胚轴

所有的操作均在超净台中进行：

① 每次大约取 20 粒无菌种子，置于解剖镜无菌的蓝色或黑色底板上，用一只镊子固定种子，另一只慑子剥出幼胚，去除胚轴（见注 4) 。

( 2 ) 每皿愈伤诱导培养基放 25~30 枚幼胚，盾片朝上，25℃ 暗培养。

3. 制备 DNA 包裹的金粉微粒

(1) 制备金粉母液

DNA 包裹金粉微粒的方法与文献 [ 9 ] 中的方法相似

① 称 40 mg 金粉于 1.5 ml EP 管中，加入 1 ml 100% 乙醇。

② 涡旋振荡使金粉充分混匀，离心使其沉淀。

③ 倒掉乙醇，重复步骤 2 两次。

④ 最后一次离心后，去除乙醇，加入 1 ml 无菌水涡旋振荡使之重悬。

⑤ 将金粉以 50 μl 分装于无菌的 EP 管中，分装时注意不断混合以保持金粉颗粒处于悬浮状态，分装后保存在 -20°C 。

(2) 亚精胺制备

① 将装有 1 g 亚精胺（Sigma- Aldrich) 的瓶子置于 65°C 水浴锅中加热使之融化。

② 用移液枪取 14 μl 溶液分装于无菌的 1.5 ml 离心管中，-20℃ 储存待用。

(3) 金粉微粒的包裹

① 从冰箱中取出亚精胺，并使其解冻。

② 加入 986 μl 无菌水，涡旋振荡混合。

③ 用 1 ml 过滤器和小的过滤器滤头（Minisart 0.2 μm 过滤器，Sartorius) 将溶液过滤到无菌的 1.5 ml 离心管中，制成 0.1 mol/L 亚精胺溶液。

④ 从冰箱中取出一管 50 μl 的金粉并使之解冻。

⑤ 沿装有金粉的离心管管壁，加入 5 μl DNA ( 1 μg/μl) ，立即涡旋振荡使金粉和 DNA 充分混合（见注 5) 。

⑥ 然后将 50 μl  2.5 mol/L CaCl2 和 20 μl 0.1 mol/L 亚精胺加入到离心管管盖中，盖好盖子，颠倒离心管使 CaCl2 和亚精胺与金粉颗粒混合（颠倒离心管之前不能让 CaCl2 和亚精胺与金粉颗粒混合），立刻涡旋振荡使所有组分充分混合。

⑦ 管子在冰上放置 1 min，然后于 1957 g 离心不超过 30 s，使金粉沉淀。

⑧ 去除上清液，加入 250 μl 100% 乙醇，用枪头轻轻吹打混匀，然后涡旋振荡，这个过程是洗涤包埋了 DNA 的金粉微粒。

⑨ 1957 g 离心不超过 30 s 沉淀金粉微粒，去除上清，加入 60 μl 100% 乙醇。

⑩ 涡旋振荡重悬金粉颗粒。DNA 包埋的金粉微粒即微载体已制备完毕。