细胞实验技术及细胞培养基本知识-2
（二）人类淋巴母细胞建株方法
1、4ml肝素抗凝血于离心管中，加入2ml RPMI 1640。
2、混匀后沿管壁缓慢加到预置有4ml淋巴细胞分离液的液面上静置30min。
3、1500rpm，15min，吸取白细胞层（第二层）于另一离心管中。
4、加RPMI 1640 5ml洗涤白细胞两次。
5、将白细胞接种至1ml RPMI 1640培养基中，加入10μl环胞霉素和100μl的EBV（EB病毒）液，混匀。
6、水浴摇床，40次/分，37℃，3hr。
7、1500rpm，15min。将细胞接种至1ml培养基中（内含谷氨酰胺1mM/ml）加入10μl环胞霉素，轻轻混匀，37℃培养。
8、5天后观察细胞转化和生长情况，决定是否半量换液。一般半量换液l～2次，并维持环胞霉素的浓度。
9、待转化细胞数量明显上升，并出现细胞团块后，可转入25ml细胞培养瓶中，加1～2ml培养基，37℃培养10～15天，一般每隔3～4天观察一次，决定是否换液，传代。
10、细胞生长达一定数量后冻存，冻存前应进行核型分析和存档。
个别组织细胞的培养
体内组织细胞在体外培养时，所需培养环境基本相似，但由于物种、个体遗传背景及所处发育阶段等的不同，各自要求条件有一定差别，所采取的培养技术措施亦不尽相同，现介绍个别组织细胞培养的要点如下:
一、上皮细胞培养
上皮细胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮组织，故上皮细胞培养特别受到重视。但上皮细胞培养中常混杂有成纤维细胞，培养时生长速度往往超过上皮细胞，并难以纯化，同时上皮细胞难以在体外长期生存，因此纯化和延长生存时间是培养关键。
体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜，因此培养在有胶原的底物上可能利于生长，另外人或小鼠表皮细胞培养在以3T3细胞为饲养层（用射线照射后）时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低PH、Ca2+含量和温度，向培养基中加入表皮生长因子，均有利于表皮细胞生长。
以表皮细胞为例，用皮肤表皮和真皮分离培养法可获得纯上皮细胞，其法如下（黑木凳志夫 1981）
1、取材：外科植皮或手术残余皮肤小块，早产流产儿皮肤更好，取角化层薄者，切成0.5－1平方厘米小块。
2、置0.02%EDTA中，室温，5分钟。
3、换入0.25%胰蛋白酶中，4℃过夜。
4、分离：取出皮块，用血管钳或镊子将表皮与真皮层分开。
5、取出表皮，剪成更小的块后，置0.25%胰酶中，37℃，30—60分钟。
6、反复吹打，制成悬液。
7、培养：用80目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸去上清。
8、直接加入培养基（Eagle加20%小牛血清）制成细胞悬液，接种入培养瓶，CO2温箱培养。
二、内皮细胞培养
内皮细胞易于从大血管分离培养成单层细胞，对于研究内皮细胞再生、肿瘤促血管生长因子（TAF）等有很大价值。
研究人内皮细胞培养以人脐带静脉灌流消化法最为简便，其法如下：
1、产后新鲜脐带，无菌剪取10—15厘米长一段，如不能立即培养，可于12小时内保存于4℃。
2、用三通注射器吸取温PBS液注入脐静脉中洗去残血，在入口处用线绳扎紧，以防液体返流。
3、用血管钳夹紧脐带一端，从另一端向脐静脉中徐徐注入终浓度为0.1%的粗制胶原酶，充满血管，消化3—10分钟；注入口用线绳扎，以防液体返流。
4、吸出含有内皮细胞的消化液，于离心管中，注入温PBS轻轻反复冲洗后，一并注入离心管中（此步骤可重复）。5、离心去上清，加入 RPMI1640培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置温箱培养。两至三天可见细胞长成单层。
