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PCR基因扩增

2019.4.23

实验概要

PCR扩增目标DNA片段。

实验原理

多聚酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成。
1. 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 2. 模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 3. 引物的延伸：DNA模板－引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性、退火、延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩增的目的基因扩增放大几百万倍。典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl₂、两个合成的DNA引物、耐热 Taq聚合酶。
除了典型的PCR外，人们还根据各种用途设计了各种不同的PCR。如： RT-PCR，即在mRNA反转录之后进行的PCR。反向PCR，常规PCR允许扩增两引物之间的DNA区段，而反向PCR则可以对靶DNA区段之外的两侧未知的DNA序列进行扩增。不对称PCR，常规PCR使用的引物浓度相同，而不对称PCR使用的引物浓度不同，两种引物浓度相差100倍。在最初20各循环中，主要产物是双链DNA。当低浓度引物被耗尽后，高浓度引物引导的PCR就会产生大量单链DNA，单链DNA可用于序列测定。

主要试剂

1. DNA模板（1ng/μL）（质粒R-pGEX-4T-1，R指代外源基因）
图1 pGEX-4T-1质粒示意图
2. 2.5mmol/LdNTP (TaKaRa) 3. 10×PCR缓冲液(TaKaRa) 4. 25mmol/L MgCl₂(TaKaRa) 5. 引物1、引物2（5pmol/μL）引物序列如下：引物1：5’-CGGAATTCATGGACGGTCAGA-3’ 引物2：5’-GCGTCGACTCATTCAGATTTGCG-3’ 6. Taq DNA聚合酶(TaKaRa) 7. 琼指糖 8. 溴化乙锭（1%EB，终浓度0.5μg/mL） 9. DNA marker 2000(TaKaRa)

主要设备

1. PCR热循环仪 2. 琼脂糖凝胶电泳系统 3. UVP凝胶成像系统 4. 移液枪（配套枪头）
5. PCR管

实验步骤

1. PCR反应体系的配制，即在薄壁管内配制25μL反应体系，按下表准确加入各反应物。

反应物	体积/μL
10×PCR缓冲液	2.5
25mmol/L MgCl₂	1.5
2.5mmol/LdNTP	2.0
引物1	2.0
引物2	2.0
Taq DNA聚合酶	0.2
模板DNA(1ng/μL)	2.0
加ddH₂O至25μL	12.8

2. PCR反应条件的设置，即在PCR热循环仪上设置程序，按程序设置的条件进行扩增。（1）94℃预变性5min；（2）94℃变性40s; （3）55℃退火50s；（4）72℃延伸50s；（5）重复步骤（2）～（4）30次；（6）72℃延伸8min；（7）12℃ for ever。
3. 1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果（此步骤与PCR扩增产物的割胶纯化一起进行。）

注意事项

PCR的每一个成份是如何影响PCR反应的： 1. 耐热DNA聚合酶 2. PCR反应的缓冲液 3. PCR引物
4. dNTP 5. 模板DNA 6. 温度循环参数

参见附件：PCR的注意事项

附件 (共2个附件,占124KB)

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