液相色谱微型化：我们为什么这样做？（一）
摘要
液相色谱 (LC) 微型化通常是为了提高灵敏度，这是蛋白质组学检测低丰度肽和蛋白质的必然要求。微型化的其他优点还包括提高与质谱连接的效率并降低溶剂的消耗。如今，微型化液相色谱更容易使用，它的仪器操作和连接方式均与常规液相色谱系统一样。这为微型化液相色谱特别是毛细管和微流液相色谱应用于新的工作流程和应用领域提供了更多机会。
关键词
RSLCnano、纳升液相色谱、毛细管液相色谱、微流液相色谱、质谱、nanoViper
引言
微型化液相色谱技术的发展始于约三十年前，1987 年出现了首批商品化产品。随着时间的推移，纳升液相色谱成为生物分析研究不可或缺的工具，尤其是在要求最高级别灵敏度的蛋白质组学领域。然而，随着纳升液相色谱在蛋白质组学实验室中的日常应用，人们有时会遗忘灵敏度提高的原理。了解这些原理及其实际影响有助于帮助人们看到微型化液相色谱将如何为蛋白质组学、生物分析等带来益处。
灵敏度 - 尺寸因素
为了解内径较小的色谱柱会使灵敏度增加这一点，首先必须明确样品浓度和样品量之间的差异。这可以归纳如下：
• 液相色谱的样品进样是指一定体积的某浓度样品的注入
- 这是一个固定量：例如 1 μL 1 pmol/μL = 1 pmol
• 进样时，这个样品固定量被液相色谱系统稀释
- 这将得到一个新的浓度
• 在相同进样量情况下，较小体积的液相色谱将产生较高浓度
- 与大内径色谱柱相比，内径较小的色谱柱灵敏度更高
图1. 相同进样量在液相色谱系统中的浓度不同
图1 显示了在内径分别为4.6 mm 和 75 μm 的色谱柱上注入相同进样量（四条“肽”），显然后者的浓度更高些。相对增加的灵敏度可以采用公式1 计算。
光学检测器（如紫外检测器）和电喷雾质谱仪属于浓度敏感型仪器。它们的信号与从色谱柱洗脱峰中样品的浓度成正比。
图2 绘制了不同直径的色谱柱较直径为4.6 毫米的色谱柱的灵敏度相对增加（按公式1 计算）。从图中可看出，内径最小（50 μm 和 75 μm）的色谱柱，其灵敏度在理论上可提高几千倍。然而，插图显示色谱柱内径从4.6 mm 变为1 mm 时，灵敏度已能得到显著提高（约20 倍）。在一些不要求绝对灵敏度，但微型化可以提供其它益处，例如与质谱轻松连接，减少溶剂用量（见计算示例）和废液处置量并降低成本的情况下，这些色谱柱内径范围完全适合实际应用。
减少溶剂用量：
设想以如下参数在内径为 4.6mm 的色谱柱上进行分析：
- 流速为1.0 mL / min
- 70％ 流动相A
- 2 公升溶剂瓶
所有流动相A 将在两天内耗尽。
采用微流速液相色谱法以50 μL/min 的流速运行本应用，500 mL 的瓶子可维持一周。
图2. 一系列内径的色谱柱相较于内径为4.6 mm 的色谱柱灵敏度的相对提高倍数
