GE-200液相色谱仪在饲料中安普霉素的测定中的应用
GE-200液相色谱仪在饲料中安普霉素的测定应用
农业部1486号公告-3-2010
本标准规定了测定饲料中安普霉素的高效液相色谱法，适用于配合饲料。浓缩饲料和添加剂预混合饲料中安普霉素的测定，方法检出限和定量限分别为3mg/kg和10mg/kg。
方法原理
饲料中的安普霉素用盐酸溶液提取，经阳离子固相萃取柱净化后，以领苯二甲醛衍生，然后用高效液相色谱分离和荧光检测器检测，以外标法进行定量。
试剂盒材料
除特殊注明外，本标准所用的试剂均为分析纯，水为去离子水，符合GB/T 6682二级用水的规定。
无水甲醇。
氨水，25%。
浓盐酸。
盐酸溶液（c(HCI)=0.10mol/L）：准确量取8.4ml浓盐酸，用水稀释至1000ml。
氨水甲醇溶液：量取20ml甲醇于100Ml容量瓶中，加入5.00ml氨水，然后用甲醇定容至刻度。
氢氧化钠溶液（c(NaOH)=6mol/L）：240g氢氧化钠溶解于1000ml水中。
硼酸盐缓冲溶液：准确称取24.73g硼酸于1000ml烧杯中，用约900ml水溶解，然后用氢氧化钠溶液调PH至9.5，并用水定容至刻度。
安普霉素标准溶液
安普霉素白哦准贮备液：准确称取安普霉素标准品（含量≥99%）0.0250g，至于25ml容量瓶中，用水溶解，并稀释至刻度，摇匀，其浓度 为1mg/ml。4℃条件下贮藏，有效期1个月。
安普霉素标准中间液：分别准确吸取标准贮备液10.00ml，置于100ml容量瓶中，用水稀释、定容，其对应的浓度为100ug/ml。
安普霉素标准工作也：取安普霉素标准中间液2.50ml、1.25ml、0.500ml、0.250ml和0.125ml分别于25.0ml容量瓶中，用硼酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，其浓度分别为10.0ug/ml、5.00 ug/ml、2.00 ug/ml、1.00 ug/ml和0.500 ug/ml。
流动相A：称取0.77g乙酸铵于1000ml容量瓶中，加水约800ml，待其溶解后，加乙酸40ml，并用水稀释至刻度，摇匀。
流动相B：乙腈，色谱纯。
具有反相与阳离子交换双重保留机制的混合型固相萃取小柱。
仪器设备
分析天平：感量为0.0001g。
磁力搅拌器。
离心机：能达3000r/min-4000r/min。
固相萃取装置。
恒温水浴锅。
氮气吹干仪。
GE-200高效液相色谱仪，Clarify色谱工作站，（Wters 474荧光检测器）。
试样制备
按GB/T 14699.1采取有代表性的样品1000g，用四分法缩减至约200g，粉碎，使全部通过0.45mm孔径的筛，婚育，贮存于磨口瓶中备用。
分析步骤
称取适量试样（配合饲料5g，浓缩饲料2g-3g，添加剂预混合饲料1g，精确至0.0001g）置于50ml离心管中，加盐酸溶液40ml，盖好盖，置于磁力搅拌器上搅拌提取25min，于离心机上3000r/min-4000r/min离心10min。上清液转移至100ml容量瓶中，再分别用35ml、25ml盐酸溶液提取2次，汇集上清液，并用盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，用中速定量滤纸过滤，滤液备用。浓缩饲料和添加剂预混合饲料上述滤液需要分别做5倍和10倍稀释。
分别用1.0ml甲醇，和1.0ml水活化固相萃取小柱，然后准确加载1.00ml样品提取液于固相萃取小柱，并以不超狗1.0ml/min的流速过柱，然后分别用1.0ml颜色溶液和1.0ml甲醇各淋洗一次，用氨水甲醇溶液洗脱至10ml试管中，然后置于60℃水浴中，用氮气吹干，用1.00ml硼酸盐缓冲液溶解后，待上机测定。
色谱柱：Vertex C18,柱长300mm，内径3.9mm，粒度5um分析柱。
柱温：室温。
流动相：流动相A——流动相B=1+1（v/v），流速1.0ml/min，洗脱时间15min。
检测器：激发波长230nm，发射波长389nm
进样量：100ul。
准确移取样品溶液400ul置于高效液相色谱仪的进样瓶中，加入200ul的衍生试剂混合，控制衍生时间5.0min,立即进样，进行分离测定。
准确移取安普霉素标准工作也400ul，进行衍生、测定，并以标准工作液的浓度对峰面积绘制工作曲线。
试样中安普霉素的含量，以质量分数（mg/kg）表示，X=n*V*p/m
X---试样中安普霉素的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）
V---制备最终用试样溶液的体积，单位为毫升（ml）
m---试样质量，单位为克（g）
p---由工作曲线计算得出的上机试样溶液中安普霉素浓度，单位为微克每毫升（ug/ml）
n---稀释倍数
测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。
允许差：同一实验室同一操作人员完成的2个平行测定的相对偏差不小于15%。
本标准遵照GB/T 1.1-2009
本标准由中华人名共和国农业部畜牧业司提出
起草单位：中国农业大学、农业部饲料工业中心
起草人：张丽英、林东下、王宗义、唱碧影、杨文君、贺平丽。
