响应面法优化隐甲藻产DHA的培养基

梅志刚^1[1]，王菊芳^2，*[2]

（华南理工大学  生物科学与工程学院  广东  广州  510006）

摘要：利用响应面法优化隐甲藻产DHA的培养基，在8种因素的单因素实验基础上，采用Plackett-Burman设计筛选出葡萄糖和胰蛋白粉为显著影响因子，维持其它组分浓度在低水平不变，对以上两因子爬坡逼近最大响应区域后利用中心组合设计和响应面分析得到最高点和主要因子的浓度。优化后的培养基组成为：葡萄糖30.54g/L, 胰蛋白粉5.03g/L，酵母粉4g/L，甘油20g/L，不添加MgCl₂和维生素溶液，其他组分同460培养基，在此培养基条件下，DHA产量达到907.54±1.02mg/L，是优化前产量的2.48倍。

关键字：隐甲藻，DHA，响应面

Response surface method for optimization of medium composition of Crypthecodinium.cohnii for DHA production

MEI Zhi-gang¹, WANG Ju-fang^2,*

Abstract: On the basis of single-factor experiments, eight factors were selected for response surface method for optimization of medium composition of Crypthecodinium cohnii. The results showed that glucose and tryptone were the significant factors by using Plackett-Burman design and other components were kept at the low concentration. Then the steepest ascent experiment was designed for the significant factors (glucose and tryptone) to reach the largest region, highest point and the concentrations of those significant factors were obtained by central composite experiments and response surface analysis. The optimized medium were as follows: glucose 30.54g/L, tryptone 5.03g/L,yeast 4g/L，glycerin 20g/L,without MgCl₂ and Vitamin solution, other components are the same with the 460 medium. After medium optimization, the DHA productivity was 907.54±1.02mg/L, as much as 2.48 times of that in primary medium.

Key words: crypthecodinium.cohnii; DHA; response surface

DHA(docosahexaenoic acid)是一种ω-3系列多不饱和脂肪酸，具有增强记忆，提高智力,降低血脂，调节免疫系统等功效，已经应用于临床和流行病学和食品添加剂^[1,4]。20世纪80年代发现，隐甲藻具有较高的产DHA能力^[2]，脂肪酸积累量高于20%，DHA含量占总脂肪酸的30%~50%，是一种高效的DHA生产菌^[2,3]，来源于隐甲藻的DHA克服了传统鱼油DHA所带有的鱼腥味、富含EPA、成本高等缺点^[6]，美国哥伦比亚Mertek公司已用该菌种实现了规模化生产。

虽然目前微藻生产DHA已工业化，但生物量和DHA的产量都相对较低^[3]，人们试图用多种方法去提高DHA产量，有优化光照条件，添加氧载体，寻找优良培养基成分，改造油脂性能等^[4]如何实现隐甲藻的高密度发酵是DHA生产的关键，各种培养基对隐甲藻培养产DHA影响较大，培养基优化是必要的^[4,5]。

发酵培养基是多成分，而且成分之间可能相互影响，单靠单因素和正交试验很难很快得到较好较严密的结果。单因素，Plackett-Burman，最陡爬坡，中心组合设计和响应面分析的依次设计是建立在多因素，多水平基础上，突出重要因子，步步逼近最大响应区，分析任何因子的一次项，平方项和任何两个因子间的一级交叉作用项的数学模型，近年来在培养基优化上使用很广。本文采取了用响应面的方法对培养基优化，以期提高隐甲藻的生物量并提高DHA产量。

1材料和方法

1.1藻种：Crypthecodinium. cohnii ATCC 30556 由中国热带农业科学院热带生物研究所提供。

1.2培养基： 460（A₂E₆） 培养基(L^-1)如下：NaCl 23.48g，MgCl₂·6H₂O 10.63g，CaCl₂1.11g，Na₂SO₄3.92g，KCl 0.66g，NaHCO₃ 0.19g，H₃BO₃ 0.03g，SrCl₂·6H₂O 0.04g，Metal Mixture 3.0ml，FeCl₃·6H₂O 0.01g，甘油磷酸钠0.15g，Tris Buffer 3.0g，Vitamin solution 1.0ml，K₂HPO₄ 0.01g，Glucose 3.0g，甘氨酸1.5g。其中Metal Mixture如下：EDTA1.0g，FeCl₃·6H₂O 0.05g，H₃BO₃ 1.0g，MnCl₂·6H₂O 0.15g，ZnCl₂ 0.01g，CoCl₂·6H₂O 0.005g，H₂O 100mL。Vitamin solution如下：Biotin 0.003g，Thiamine 1g，H₂O 1L。

1.3主要测定和分析方法:

1.3.1菌种活化，培养及收集：取4℃保藏的菌种10%接入装液量5mL试管，25℃，150r/min培养两天后5%接种量转接到装液量10mL的摇瓶，25℃，150r/min培养两天作为实验的种子液。种子液以5%接种量接入装液量50mL的250mL摇瓶，25℃，150r/min培养5天收集菌体。10000r/min离心10min,蒸馏水清洗3次。-40℃，0.317帕，冻干称量至恒重。

1.3.2 脂肪酸提取：改进的Bligh--Dyer法^[9,10]。

1.3.3脂肪酸甲脂化^[13]

1.3.3色谱检测条件：采用Agilent 7890A气相色谱仪，FID检测器，19091N-113 HP-INNOWAX毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25μm)；载气为N₂，进样口温度250℃，检测器温度300℃。程序升温，130℃保温1 min，以5℃/min升温到250℃保温8 min，总运行时间33.00 min。

1.3.4计算方法^[11]：每个点做三次平行取平均值，数据处理和实验设计分别在Excel和Minitab辅助下完成

1.4单因素实验^[7]：以460medium为基础，外加甘油，酵母粉，胰蛋白粉，乙醇，研究其中含量较多和重要的8种成分，为PB实验设计作参考。

1.5  Packett-Burman实验设计^[8,12]

在单因素实验基础上，选取对DHA产量影响较大的8个因素，进行12次的Packett-Burman设计实验，筛选出重要影响因子。

1.6 最陡爬坡实验

对筛选出的因子根据方程进行最陡爬坡设计，以坡的最高点作为后续中心组合的中心点。

1.7 响应面分析

根据Box-Behnken的中心组合原理，设计合适的水平，中心点重复多次，用Minitab软件分析，对得到的理论最高点做3次重复验证。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

对葡萄糖，甘油，乙醇，胰蛋白粉，酵母粉，氯化钠，氯化镁，维生素溶液8因子进行单因素实验。结果表明以上组分浓度分别为30(g/L)，20(g/L)，5(g/L)，5(g/L)，5(ml/L)，24g/L，10.4g/L，1ml/L时DHA产量分别达到最高为： 521.3±1.12(mg/L)，626.24±1.02(mg/L)，709.54±1.02(mg/L)，759.07±1.12(mg/L)， 812.78±1.12(mg/L)，835.32±0.98(mg/L)，855.77±1.02(mg/L)，860.12±1.00(mg/L)。依此为Packett-Burman设计合理的浓度水平，其中原始460培养基DHA产量365.48±1.12(mg/L)。