实验材料 DNA

试剂、试剂盒 TE核苷三磷酸混合液RNA聚合酶缓冲液异丁醇NaOHTCA

仪器、耗材 离心机摇床

实验步骤

1.  亚克隆编码蛋白质的目的DNA片段于质粒载体的SP6或T7启动子的下游。

2.  通过CsCl/溴化乙锭离心或PEG沉淀制备质粒DNA。

3.  用位点在终止密码子的立即下游处（理想是50~200碱基）而不存在于蛋白质编码区中的限制性内切酶切割DNA。取小份样品在琼脂糖凝胶电泳中检测。

4.  酚抽提及乙醇沉淀纯化DNA，重溶于50 μl TE缓冲液。

5.  在室温建立如下的25 μl 的反应混合液（避免精胺使DNA模板沉淀）

8 μl  H2O

5 μl  DNA

5 μl  5×核苷三磷酸混合液

2.5 μl  10×SP6或T7 RNA聚合酶缓冲液

2.5 μl 10 mmol/l 精胺

1 μl  RNAsin

1 μl  SP6/T7 RNA聚合酶

于40℃保温60 min，如用T7 RNA聚合酶反应，不加精胺，补加2.5 μl 水。

6.  加入25 μl 缓冲液平衡酚，振荡混匀，立即抽提。转移水相于一个新微量离心管中，以异丁醇抽提两次。加入6 μl 10 mol/l 乙酸铵和70 μl 乙醇，沉淀RNA并以乙醇洗1次。

7.  重溶RNA于24 μl TE缓冲液，加入6 μl 10 mol/l 乙酸铵和70 μl 乙醇，沉淀RNA并以乙醇洗1次。重溶RNA沉淀于10 μl TE缓沖液，RNA应立即进行体外转录或急冻后存于-70℃。

8.  按厂商的说明书往体外翻译试剂盒的配套试剂加入1~10 μl RNA。加入15 μCi［35S］标记甲硫氨酸，典型的反应在30 μl 体枳室温进行30~60 min。反应完成后，可在0~4 ℃保存1周。

9.  取1 μl 翻译反应的产物加入到50 μl 0.1 mol/l NaOH，于37℃放置15 min 加入1 ml，10%TCA在冰上放置15 min。将沉淀收集于玻璃纤维滤膜上，用液闪计数仪测定大量掺入的［35S］甲硫氨酸。

10.  取3 μl 翻译反应产物，用单问SDS-PAGE电泳包括蛋白质分子量标准。用 EN3HANCE荧光自显影使［35S］蛋白质显迹和放射自显彩1~4 h。