原代细胞分离与培养，你都掌握了吗？
对于大部分科研人员来说，研究中一般用到均是现成的细胞系/株，我们只需要：进行细胞传代和保种。然而，这些细胞系常常由于体外长期培养，而丢失原有生物学特性，对药物处理的反应差距越来越大。因此，原代细胞的地位日渐凸显，Paper中若有了原代细胞的数据都会添色不少。然而，就小编亲生经历，原代细胞分离着实是个技术活，今天我们就结合自身经验，为大家介绍：肿瘤组织和正常组织的原代细胞的分离与培养方法。
第一部分：原代细胞的基本知识
1. 什么是原代细胞培养?
原代细胞（Primary cells）：是指直接从机体取出的组织或细胞获得单个细胞并在体外进行培养的细胞。这里的组织主要指：组织器官、外周血及胚胎等。
原代细胞培养：由于原代细胞生长缓慢，繁殖一定的代数停止生长（一般10代以内）。所以一般认为：培养的原代的第1和传代到第10代以内的细胞统称为原代细胞培养。
2. 原代细胞与细胞系（cell lines）的区别
原代细胞和细胞系的比较：
Primary cells
Cell lines
增殖能力
较弱
强
繁殖代数
一般只能传10代以内
无限增殖，50代左右
遗传物质完整性
遗传物质未改变
遗传物质发生改变
生物特性
最接近临床样本
偏离临床样本
培养容易程度
比较复杂
简单，易操作
原代细胞和细胞系的比较
3. 原代细胞的应用
由于原代细胞生物学特性未发生很大改变，最接近和反映体内生长特性，因此是：
(1) 研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的工具；
(2)更好实现精准医疗的肿瘤诊治模式，实现个体化精准用药的目的。
第二部分：原代细胞分离和培养技术
原代培养的原理
将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶(常用胰蛋白酶/胶原酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。主要包括取材——分离——培养等3部分；
在原代细胞应用较多的包括：组织器官（如实体瘤、皮肤等）、悬浮细胞的取材等。
下面依次介绍：
一、肿瘤组织的取材
病人自体的原代肿瘤细胞由于更接近临床患者标本，可以更好实现精准医疗的肿瘤诊治模式，实现个体化精准用药的目的。所以对病人自体肿瘤细胞体外分离与培养十分必要。
基本过程如下图所示：
原代肿瘤细胞的分离步骤
备注：上图细胞为肉瘤患者的原代细胞
具体步骤如下：
1. 在无菌条件下的冰上对新鲜离体的肿瘤组织，剔除包膜及坏死组织，无菌PBS清洗3-5次；切成约1mm3组织块；
2. 加入2mmol 的 EDTA，摇匀后放置冰上约 30-60min；
3. 离心，并加入胶原酶消化（含蛋白酶）；
4. 消化期间，置于37°培养箱。每15min摇晃一次，消化时间根据肿瘤组织来定，约1-2h；
5. 待大部分组织块消化成透明状时，用 40μm 的细胞滤网过滤细胞，收集；
6. 用培养基重悬，置于培养箱培养。
常见问题解答：
Q：为什么我取得原代肿瘤组织，分离的却不是肿瘤细胞？
A：取材时，我们要熟悉所需组织的类型和部位特征，选择肿瘤细胞集中、活力较好的部分。避免结缔等正常组织。
Q：若是细胞中混成纤维细胞，如何去除？
A：成纤维细胞的去除对于肿瘤细胞培养十分重要。由于成纤维细胞贴壁速度较肿瘤细胞快，可利用反复贴壁法使二者分离，进而达到清除成纤维细胞的目的。
Q：为什么离心后，没有细胞分离出来？
A：需要考虑消化酶的因素，由于肿瘤组织较致密，胰酶无法消化，一般选用胶原酶，如胶原酶Ⅳ。若是组织十分致密可以再结合机械法，如研磨或者搅拌加速细胞分散。如下表为二者的区别：
胶原酶
胰酶
来源
细菌
胰脏
消化组织
纤维多的硬组织
软组织
对细胞影响
伤害小
长时间有损伤
作用力度
缓和
强
注：胶原酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝细胞专用胶原酶，根据分离的组织类型需选择合适的胶原酶类型。
Q：消化时间如何确定？
A：具体的消化酶的量和消化时间可根据组织类型和多少进行调整。
Q：消化之前为什么用EDTA?
A：EDTA是一种非酶消化物，又称螯合剂，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好。与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物后，形成的机械力可使细胞分散。
Q：细胞量太少，长不起来怎么办？
A：有几种办法，如对没消化完的组织块反复消化，尽量多收集一些细胞；并且尽量传代到小皿里，如6孔板都可以。若是细胞仍太少，应耐心等待，尽量不要传代，只换液。
Q：细胞难以贴壁？
A：尽快使接种的细胞贴壁，是决定培养能否成功的关键。为了尽快促进细胞贴壁，可以提前1h将千分之的明胶铺于培养板。
Q：肿瘤原代细胞培养方法与细胞系不同之处在哪里？
A：培养基一般选用RPM1640，DMEM等，建议最好能加入促生长的物质：如胰岛素、氢化可的松、雌激素、EGF等因子。
二、 原代正常组织分离
皮肤是人体最大的器官，但长久以来，表皮细胞一种被认为是难以培养的细胞，限制了皮肤生物学基础研究的发展。作为表皮的主要细胞，角质形成细胞已经成为我们了解皮肤生物学至关重要的许多原创性研究的焦点。
下面就介绍下小鼠角质形成细胞的分离和培养。基本过程如下图：
原代小鼠角质细胞的分离步骤
实验结果：
分离出的小鼠角质细胞
常见问题解答：
Q：皮肤组织作为正常组织，与肿瘤组织分离主要区别在哪里？
A：首先，皮肤组织需要用中性分离酶dispaseII将表皮分离出来；其次，在消化时，用的是胰酶，而非胶原酶，并且胰酶的浓度用的是0.05%，而不是0.25%。
Q：表皮的分离需要注意什么？
A：表皮一般可以完整的撕脱下来，温度的变化，孵育的时间以及所用的酶的浓度都会影响表皮是否能完整剥离。
Q：为什么需要无Ca血清来终止消化？
A：因为Ca2+的浓度可以影响角质形成细胞的生长，并且培养时必须严格调控培养基中的Ca2+浓度。
三、悬浮细胞分离培养
对于悬浮的原代细胞，如腹水或者胸水的癌细胞，可以直接低俗离心，将细胞洗涤几次后置于合适培养基中。若是人为的骨髓或者外周血，则需要淋巴细胞分离液分层后再接种培养。
具体步骤我们这里不再赘述。若有相关问题，可以给我们留言。
悬浮细胞分离的注意事项：
分离后，注意抗凝，还要尽快分离后培养。不适合长时间低温存放。
本期的内容就介绍到这里了，原代细胞分离培养与细胞系相比，难度加大了很多，不管哪一种组织的分离，一定要注意无菌。原代细胞是我们研究的重要工具。大家需要在实践中多多练习，摸索最适合自己组织的分离方法和培养条件。
备注：肿瘤组织的原代细胞图片提供者：王为芳；
小鼠角质细胞原代细胞图片提供者：许鹏。
