凝胶渗透色谱GPC/凝胶过滤色谱GFC基础知识
凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography, GPC）是1964年，由J.C.Moore首先研究成功。不仅可用于小分子物质的分离和鉴定，而且可以用来分析化学性质相同分子体积不同的高分子同系物（聚合物在分离柱上按分子流体力学体积大小被分离开），优点是：保留时间短，色谱峰窄，容易检测等。
凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。
技术介绍
凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。凝胶色谱法主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC）和凝胶渗透色谱（GPC）。 GFC一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。凝胶渗透色谱法主要用于有 机溶剂中可溶的高聚物(聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等)相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。凝胶色谱不但可以用于分离测定高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离油溶性和水溶 性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。近年来，凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物。化学结构不同但相对分子质量相近的物质，不可能通过凝胶色谱法达到完全的分离纯化的目的。凝胶色谱主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。
凝胶色谱法图示
基本原理
分子筛效益
两种全排阻的分子即使大小不同，也不能有分离效果。直径比凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙。如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小有差别，也不会有好的分离效果。因此，一定的分子筛有它一定的使用范围。综上所述，在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子较小的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小的移动距离较长。于是分子较大的先通过凝胶床而分子较小的后通过凝胶床，这样就利用分子筛可将分子量不同的物质分离。另外，凝胶本身具有三维网状结构，大的分子在通过这种网状结构上的孔隙时阻力较大，小分子通过时阻力较小。分子量大小不同的多种成份在通过凝胶床时，按照分子量大小“排队，凝胶表现分子筛效应。
重要参数
⑴柱体积：柱体积是指凝胶装柱后，从柱的底板到凝胶沉积表面的体积。在色谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶床，因此柱体积又称“床”体积，常用Vt 表示。
⑵外水体积：色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积称外水体积，亦称间隙体积，常用Vo表示。
⑶内水体积：因为凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，这就分间隙的总和为内水体积，又称定相体积，常用Vi表示。 不包括固体支持物的体积（Vg）。
⑷峰洗脱体积：是指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液有体积，常用Ve 表示。当使用样品的体积很少时，（与洗脱体积比较可以忽略不计），在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用洗脱液体积为Ve。 当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时，洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰顶位置。当样品很大时，洗脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）。
填料合成
凝胶色谱填料合成技术的进展主要在下面四个方面：填料的微球化、窄粒度分布多孔硅微球的合成成功、小孔径多孔硅微球合成成功以及新的硅微球表面化学改性的发展。近年来在这方面有较多的新产品，中国也有许多单位在研制和生产。高效凝胶色谱正在迅速改变凝胶色谱的应用面。
高效色谱柱除了对填料的粒度有要求外，对粒度分布也要求相当窄。用一般的制备方法往往得到粒度较宽的产品，需要进一步过筛。当填料的粒度在30微米以下时，这种过筛非常困难，已经成为填料制备上一个较大的技术难关。Kirkland，最近利用了尿素和甲醛在酸性介质中形成大小均匀的液体高聚物，加入某种硅溶胶时，硅溶胶的微珠将在液体高聚物中凝聚。最后把有机高聚物灼烧掉后就能得到由微粒硅珠堆积而成的多孔填料。这种堆积硅珠是球形的，粒度分布很窄，填料的孔径决定于原始硅溶胶的规格，用不同的硅胶就可以制得不同孔径的填料。柴志宽等则利用一种硅胶制成粒度分布窄的填料后，再利用适当的扩孔方法以得到各种孔径的填料。从这些方法制得的微球填料，粒度分布可以达到相当窄，所以可以不经筛选直接使用。
随着进样技术和色谱柱接头设计的改进，已经可以得到柱效每米在八万到十万的凝胶色谱填料。Wheals用四种GPC用的微球硅胶装填色谱柱，都能达到每米八万到十万块塔板数的高效。他用这种色谱柱有效地进行了案件侦查中所要求的分析问题。
两大分类
根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC）和凝胶渗透色谱（GPC）。
凝胶过滤色谱
凝胶过滤色谱一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。
凝胶渗透色谱
凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物 (聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等) 相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。
凝胶色谱不但可以用于分离测定高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离油溶性和水溶性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。
近年来，凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物。化学结构不同但相对分子质量相近的物质，不可能通过凝胶色谱法达到完全的分离纯化的目的。
GPC分离原理
凝胶具有化学惰性，它不具有吸附、分配和离子交换作用。让被测量的高聚物溶液通过一根内装不同孔径的色谱柱，柱中可供分子通行的路径有粒子间的间隙（较大）和粒子内的通孔（较小）。当聚合物溶液流经色谱柱（凝胶颗粒）时，较大的分子（体积大于凝胶孔隙）被排除在粒子的小孔之外，只能从粒子间的间隙通过，速率较快；而较小的分子可以进入粒子中的小孔，通过的速率要慢得多；中等体积的分子可以渗入较大的孔隙中，但受到较小孔隙的排阻，介乎上述两种情况之间。 [1]经过一定长度的色谱柱，分子根据相对分子质量被分开，相对分子质量大的在前面（即淋洗时间短），相对分子质量小的在后面（即淋洗时间长）。自试样进柱到被淋洗出来，所接受到的淋出液总体积称为该试样的淋出体积。当仪器和实验条件确定后，溶质的淋出体积与其分子量有关，分子量愈大，其淋出体积愈小。
（1）体积排除
（2）限性扩散
（3）流动分离
校正原理
用已知相对分子质量的单分散标准聚合物预先做一条淋洗体积或淋洗时间和相对分子质量对应关系曲线，该线称为“校正曲线”。聚合物中几乎找不到单分散的标准样，一般用窄分布的试样代替。在相同的测试条件下，做一系列的GPC标准谱图，对应不同相对分子质量样品的保留时间，以lgM对t作图，所得曲线即为“校正曲线”。通过校正曲线，就能从GPC谱图上计算各种所需相对分子质量与相对分子质量分布的信息。聚合物中能够制得标准样的聚合物种类并不多，没有标准样的聚合物就不可能有校正曲线，使用GPC方法也不可能得到聚合物的相对分子质量和相对分子质量分布。对于这种可以使用普适校正原理。
普适校正原理
由于GPC对聚合物的分离是基于分子流体力学体积，即对于相同的分子流体力学体积，在同一个保留时间流出，即流体力学体积相同。
两种柔性链的流体力学体积相同：
两边取对数：
即如果已知标准样和被测高聚物的k、α值，就可以由已知相对分子质量的标准样品M1标定待测样品的相对分子质量M2。
凝胶种类
聚丙烯酰胺凝胶
凝胶色谱法
是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位， 由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。交联剂越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶－P （Bio-Gel P），由日本Tosoh的TSKGEL的pw系列，适合蛋白和多糖的纯化。
Tosoh的TSKGEL的pw系列
交联葡聚糖凝胶
⑴Sephadex G交联葡聚糖的商品名为Sephadex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200克每克干胶吸水20克。交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。因此，“G”反映，凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。
⑵Sephadex LH-20，是─Sephadex G-25的羧丙基衍生物， 能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。
琼脂糖凝胶
商品名很多，常见的有，Sepharose（瑞典，pharmacia ），Bio-Gel-A（美国Bio-Rad）等。琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。
实验技术
层析柱
层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管。层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径，一般制备用凝胶柱，直径大于2厘米，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。此外， 直径加大，洗脱液体体积增大，样品稀释度大。分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过1米。分族分离时用短柱，一般凝胶柱长20-30厘米，柱高与直径的比较5:1─10:1，凝胶床体积为样品溶液体积的4-10倍。 分级分离时柱高与直径之线为20:1─100:1，常用凝胶柱有50×25厘米，10×25厘米。层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支掌滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现拖尾出象，降低分辨力。在精确分离时，死体积不能超过总床体积的1/1000。
根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。 一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2倍，例如Sephadex G-20的吸水量为20，1 克Sephadex G─200吸水后形成的凝胶体积约40ml。凝胶的粒度也可影响层析分离效果。粒度细胞分离效果好，但阻力大，流速慢。一般实验室分离蛋白质采用100-200号筛目的的Sephadex G-200效果好， 脱盐用Sephadex G-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快。
凝胶的制备
商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可用加热法，即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样可大大中速膨胀，通常在1-2小时内即可完成。特别是在使用软胶时， 自然膨胀需24小时至数天，而用加热法在几小时内就可完成。这种方法不但节约时间，而且还可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。
样品溶液处理
样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去，如含脂类可高速离心或通过Sephadex G-15短柱除去。样品的粘度不可大，含蛋白为超过4%，粘度高影响分离效果。上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。分离蛋白质样品的体积为凝胶床的1-4%（一般约0.5-2ml），进行分族分离时样品液可为凝胶床的10%，在蛋白质溶液除盐时，样品可达凝胶床的20-30%。 分级分离样品体积要小，使样品层尽可能窄，洗脱出的峰形较好。
防止微生物污染
交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质，防止微生物的生长，在凝胶层析中十分重要，常用的抑菌剂有:
⑴叠氨钠（NaN3）
在凝胶层析中只要用0.02%叠氮钠已足够防止微生物的生长，叠氮钠易溶一水，在20℃时约为40%；它不与蛋白质或碳水化合物相互作用，因此叠氮钠不影响抗体活力；不会改变蛋白质和碳水化合物的层析我特性。叠氮钠可干扰荧光标记蛋白质。
⑵可乐酮[Cl3C-C(OH)(CH3)2]
在凝胶层析中使用浓度为0.01-0.02%。在微酸性溶液中它的杀菌效果最佳，在强碱性溶液中或温度高于60℃时易引起分解而失效。
⑶乙基汞代巯基水杨酸钠
在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为0.05-0. 01%。在微酸性溶液中最为有效。重金属离子可使乙基代巯基的物质结合，因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌效果。
⑷苯基汞代盐
在凝胶层析中使用浓度为0.001-0.01%。在微碱性溶液中抑效果最佳，长时间放置时可与卤素、硝酸根离子作用而产生沉淀；还原剂可引起此化合物分解；含疏基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。
实验部分
直接法：在测定淋出液浓度的同时测定其粘度或光散射，从而求出其分子量。
间接法：用一组分子量不等的、单分散的试样为标准样品，分别测定它们的淋出体积和分子量，则可确定二者之间的关系。
仪器
GPC仪的组成：泵系统、（自动）进样系统、凝胶色谱柱、检测系统和数据采集与处理系统。
2.1.1.泵系统：包括一个溶剂储存器、一套脱气装置和一个高压泵。它的工作是使流动相（溶剂）以恒定的流速流入色谱柱。泵的工作状况好坏直接影响着最终数据的准确性。越是精密的仪器，要求泵的工作状态越稳定。要求流量的误差应该低于0.01mL/min。
2.1.2.色谱柱：GPC仪分离的核心部件。是在一根不锈钢空心细管中加入孔径不同的微粒作为填料。每根色谱柱都有一定的相对分子质量分离范围和渗透极限，色谱柱有使用的上限和下限。色谱柱的使用上限是当聚合物最小的分子的尺寸比色谱柱中最大的凝胶的尺寸还大，这时高聚物进入不了凝胶颗粒孔径，全部从凝胶颗粒外部流过，这就没有达到分离不同相对分子质量的高聚物的目的。而且还有堵塞凝胶孔的可能，影响色谱柱的分离效果，降低其使用寿命。色谱柱的使用下限就是当聚合物中最大尺寸的分子链比凝胶孔的最小孔径还要小，这时也没有达到分离不同相对分子质量的目的。所以在使用凝胶色谱仪测定相对分子质量时，必须首先选择好与聚合物相对分子质量范围相配的色谱柱。
2.1.3.填料（根据所使用的溶剂选择填料，对填料最基本的要求是填料不能被溶剂溶解）：交联聚苯乙烯凝胶（适用于有机溶剂，可耐高温）、交联聚乙酸乙烯酯凝胶（最高100℃，适用于乙醇、丙酮一类极性溶剂）多孔硅球（适用于水和有机溶剂）、多孔玻璃、多孔氧化铝（适用于水和有机溶剂）
2.1.4.柱子：玻璃、不锈钢
2.1.5.检测系统：通用型检测器：适用于所有高聚物和有机化合物的检测。有示差折光仪检测器、紫外吸收检测器、粘度检测器。
2.1.6.示差折光仪检测器：溶剂的折光指数与被测样品的折光指数有尽可能大的区别。
2.1.7.紫外吸收检测器：在溶质的特征吸波长附近溶剂没有强烈的吸收。
2.1.8.选择型检测器：适用于对该检测器有特殊响应的高聚物和有机化合物。有紫外、红外、荧光、电导检测器等。
操作
2.2.1.溶剂的选择：能溶解多种聚合物；不能腐蚀仪器部件；与检测器相匹配。
2.2.2.把激光光散射与凝胶色谱仪联用，在得到浓度谱图的同时，还可得到散射光强对淋出体积的谱图，从而计算出分子量分布曲线和整个试样的各种平均分子量。
2.2.3.激光光散射实验中必须对样品严格除尘，溶液中的灰尘会产生强烈的光散射，严重干扰聚合物溶液光散射的测量。溶液除尘是光散射成败的关键。首先是溶剂除尘，配置测试样品的溶剂应进行精馏，并经过0.2μm超滤膜过滤后方可使用。配好的溶液也要用0.2μm的超滤膜过滤。另外，测试中所用的器械，如：注射器等，使用前要用洗液浸泡，清水强力冲洗。
优点
（1）全部组分均在溶剂分子洗脱之前洗脱下来，分离时间短。
（2）可以预测洗脱时间，可以连续进样。
（3）凝胶色谱的分离过程不依靠分子间作用力，一般情况下，没有强保留的分子累积在色谱柱，所以分离时试样组分不会丢失，柱的使用寿命也会延长。
（4）保留时间短，色谱峰窄，容易检测。 [1]
应用
凝胶色谱不但可以用于分离测定高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离脂溶性和水溶性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。近年来，凝胶色谱也广泛用于小分子化合物。相对分子质量相近而化学结构不同的物质，不可能通过凝胶渗透色谱法达到完全分离纯化的目的。凝胶色谱不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量相差需在10%以上才能得到分离。
研究动向
凝胶色谱的大量研究工作仍是多方面的，其中仪器、填料、联用技术、色谱理论等方面的进展是和整个液体色谱的进展相关的。但是下面四个研究动向意义较大，值得注意。通过与其他仪器联用，解决凝胶色谱法测定高聚物分子量分布从相对法向绝对法过渡。测定高聚物分子量分布是凝胶色谱最重要的应用。试样先根据分子体积(即分子量)分离后再检测各组分的分子量及含量。在凝胶色谱中试样的分离是在色谱柱中进行的，被分离后的组分在流出柱子时就同时连续地用浓度检测器和分子量检测器分别检测各组分的浓度和分子量，把两个检测器的输出讯号用记录仪记录后即得反映分子量分布的凝胶色谱曲线。过去由于没有比较灵敏和瞬时响应的分子量检测器，因而利用一组不同分子量的标样来标定色谱柱，然后从分子量淋出体积的标定曲线来作数据换算。这种用相对方法来检测分子量虽然暂时解决了问题，但是随之而来的是实验工作量增加以及数据处理方法上存在困难。实验数据的可靠性在很大程度上决定于标定曲线、标样分子量数值以及数据处理方法的可靠性。其中色谱柱分离效率不理想所引起的色谱峰加宽效应的改正，不但实验方法比较烦琐，而且数据处理也比较复杂，需要用电子计算机来计算。所以虽然文献中已经推荐许多据说是比较满意的计算方法，但这总不是一个根本解决的方法。只有真正找到绝对分子量检测器，问题才算较好解决。原有的许多分子量测定方法，由于不能做到足够灵敏的瞬时响应而未能成功地在凝胶色谱上应用。最近Ouano用激光小角光散射仪(LALLS)来作分子量检测器得到比较好的结果。实验数据不需要标定曲线，也不必进行峰加宽改正。
由于激光的准直性较好，强度较大，可以允许在较小的角度下测量较稀溶液的散射光强，由此可以直接计算出重均分子量的近似值而不需要象经典光散射那样实验数据还要对浓度和散射角度向零作双外推。实验上，凝胶色谱仪和激光小角光散射仪联用后，还可与计算机直接联接进行数据处理。在一次实验进行完毕后，所需要的数据可全部立即取得。GPC-LALLS似乎得到更合理的数值。激光小角散射仪已开始商品化，预计不久将会有更多的研究工作，来说明已经在何种程度上解决了凝胶色谱的相对测定过渡到绝对测定。
凝胶色谱中的浓度检测器和通常的液体色谱一样仍然是一个薄弱环节，继续在寻找更理想的检测器。最常用的仍然是示差折光检测器和紫外检测器。
最近Hoffmann和Urban用自动浊度滴定装置来作浓度检测器也收到一定效果，特别对二元共聚中测定分子量分布和组成分布，效果比较显著。Jorgenson等用光散射法测定淋出溶质的沉淀，也证明是一个较灵敏的方法。Francois等用密度计来检测浓度，提供了另一条通用性检测器的途径。其他如质谱和原子吸收光谱也都能与凝胶色谱联用。随着应用的扩大，凝胶色谱可以用于测定高聚物长支链的支化度。
